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辣根过氧化物酶标记抗体技术及应用进展;实验原理;（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O ;b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 ; 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。 ; 四 操作步骤 （1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。 （2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO４溶液，混匀， 4℃静置30分钟。 （3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀， 静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。 　 ;（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉??物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 ;酶制剂及其底物;由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。;HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下: 　　　　　　　　　　　　　　　HRP 　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O 　　供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早 期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定