Western_Blot技术详解(南京大学)--原理,流程,细节,注意事项!史上最全!.pdfVIP

Western Blot —实验方法和注意事项 南京大学 医药生物技术国家重点实验室 2011-04-11 WB流程 原理 蛋白免疫印迹： SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳。堆积胶（压缩蛋白）+分离胶 （分子筛） 原理： 根据分子量大小分离蛋白。形成的SDS-protein复合物，椭圆棒状，使 泳动率只是分子量的函数。 转膜：半干法和湿法 固相载体 （硝酸纤维素膜(NC 膜)和PVDF 膜）以非共价键形式吸附蛋 白质。 免疫检测： 特异性的一抗→或者通过酶标的二抗（碱性磷酸酶（AP ）或辣根过 氧化物酶（HRP）标记）→底物显色(膜上的颜色或荧光、X 光底片暴 光) 主要试剂 1、30 %(w/v)丙烯酰胺 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺=29:1 4℃避光保存。PH7.0，脱氨基反应是光催化或碱催化的。保质期约为两 个月。 消化道、呼吸道、皮肤粘膜等多种接触途径，可导致遗传物质损伤和基 因突变。具有神经毒性，可致癌。 2、10%(w/v) SDS ：室温保存。粉末对粘膜、上呼吸道、眼和皮肤有刺激 作用。 3、1.5mMTris-HCL(pH8.8):过滤后4 ℃保存。 4 、0.5mMTris-HCL(pH6.8):过滤后4 ℃保存。 这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL 。 5、TEMED原溶液 （四甲基乙二胺）催化AP形成自由基而加速两种丙稀 酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。极易挥发，用完一定要拧 紧瓶盖！有腐蚀性和神经毒性 6、10%(w/v)AP ：提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。最好临用前 配制，4 ℃保存1周。对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性 主要试剂 7、SDS加样缓冲液:pH6.8 Tris缓冲液、甘油、SDS 、巯基乙醇 （高毒、杀虫剂原料、易爆品，新鲜配制！）、溴酚蓝混匀备用。 8、10 ×Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸 馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临 用前稀释10倍。 9、1 ×转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS ，并加入200ml 甲醇 （神经系统、血液系统，甲醇蒸气能 损害人的呼吸道黏膜和视力），加水至总量1L。提前配制。 10、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液 (PBS)。可以防止抗体失活，但会稍影响结合效率，并使HRP失活。 11、PBST(缓冲能力强)、TBST(洗脱效果好) 12、细胞裂解液 蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 倒掉培养液→预冷的PBS洗涤细胞→弃去洗液→加裂解液 （PMSF 100mM/PI 1:100）， 吹匀置于冰上。→冰上裂解30min （不要超过1h），为使细胞充分裂解要经常弹细 胞。→于4 ℃下12000rpm离心10min。→离心后的上清取1ul测浓度，其余加loading 煮样后分装放于-20℃保存（1周），-80℃ （1月-1年）。每次上样前要煮样2min， 并室温10000rpm离心1min。 超声：细胞+裂解液+loading 十几秒 冰上 （2 ）组织中总蛋白的提取： 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 注意： 1.电磁炉使用安全，不可烧干 （加水）。最好不要走开。 2.金属浴防烫手。 3.样品EP管盖易弹开。 蛋白含量的测定 Bradford法: 原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合, 由棕色变成蓝色,595nm检测. 去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. （1）制作标准曲线 1、溶解高浓度的BSA标准品 2、分别配制浓度为0mg ，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg