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Module6：定量PCR数据常见问题分析-ThermoFisherScientific
Module 6 ：定量PCR数据常见问题分析
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1
常见问题一 : 抑制物（Inhibition）
2
扩增曲线斜率不一致提示存在抑制物
• 在指数增长期，扩增曲线的斜率应当有良好的一致性，即所
有的曲线都应该是平行的。
• 如果扩增曲线的斜率不一致，就提示可能样本的质量不好。
PCR inhibitors?
3
PCR抑制物
• 黑色素 • 乙醇
• 多糖类 • 蛋白酶K
• 血红蛋白 • 胍盐
• 尿素 • 苯酚
• 其他
4
检查样本质量
• 用分光光度计测量样品260/280 比值。
• DNA纯度：OD260/OD280=1.8
• RNA纯度：OD260/OD280=2.0
• 将样品梯度稀释，制作标准曲线
5
标准曲线检查DNA样本质量
• 以一个高浓度的样本(cDNA or gDNA)作为起始样本
• 对样本进行梯度稀释
• 每个稀释度重复三次进行绝对定量实验
• 检查标准曲线的线性
6
抑制物的存在导致PCR过程受到抑制
• 正常标准曲线所有的点都应该落在同一条线上
Inhibition
• 抑制物的影响可以通过稀释样品消除
7
抑制物同时会抑制逆转录反应
• 以RNA为起始模板, 也会受到抑制物的影响。
• 逆转录很容易受到抑制物的影响, 使得cDNA的产量下降.
• 检测不同浓度RNA进行RT的效率是检测是否存在抑制物的
好方法。
8
如何检测RT反应中的抑制物?
制作RNA标准曲线
9
如何制作RNA标准曲线？
RT
RNA (undil.) cDNA
RT
1:10 dilution
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