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谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力 课前思考题 蛋白质定量测定常见的方法有哪些？ Folin-酚法测定蛋白质含量的原理是什么？它具有什么优点和缺点？ 在实验操作中应注意哪些问题？（参考定磷法） 酶的比活力的意义是什么？计算时应注意哪些问题？ 蛋白质定量测定常见的方法 目前常用的蛋白质含量测定方法有两类：一类是利用蛋白质的物理化学性质，另一类是利用化学方法来测定，可以根据实验要求和实验室条件选择适当的测定方法。 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理 第一步反应 蛋白质的肽键与双缩脲结构相似，与甲试剂中的酒石酸钾钠-铜盐溶液起作用，发生双缩脲反应，在碱性条件下，生成Cu2+-蛋白质络和物。双缩脲反应仅与蛋白质的肽键结构有关，不受蛋白质氨基酸组成差异的影响。 操作步骤每人取16支试管，按下表平行操作： 注意事项 1. 用移液管准确移取溶液，要求标准蛋白质用差量法，溶液尽量放入试管底部。 2. 注意加样顺序和平行操作。 3. 加入酶液蛋白质的量应在标准曲线范围之内。 4. 加入乙试剂后，应迅速混匀（加一管混匀一管），避免乙试剂被破坏。 数据处理 1．绘制标准曲线：每一点吸光值取平均，并扣除空白管的吸光值，以其为纵坐标，每管标准蛋白质含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线应过原点； 2. 计算待测蛋白质溶液的浓度：用待测蛋白质的吸光值在标准曲线上查出其对应的蛋白质含量（取在标准曲线范围内的一点计算即可），根据实验中所加入待测蛋白质溶液的体积计算出其浓度（μg/mL或mg/mL）； 课后思考题 实验设计：现有1种标准蛋白质溶液，3种未知溶液（已知它们分别是水、蛋白质溶液和胰蛋白酶溶液），蛋白质定量测定试剂，利用恒温箱，可见分光光度计及玻璃仪器，通过实验确定这3种溶液哪一个是水、蛋白质溶液和胰蛋白酶溶液。 * * ? 法紫外吸收：利用蛋白质在280nm处有吸收高峰，操作简便，不损失样品，受核酸的干扰。 ? 双缩脲法：利用蛋白质的双缩脲反应测定，常量法灵敏度较低，但操作简便，硫酸铵不干扰，利于蛋白质纯化早期步骤的快速测定；微量法灵敏度高。 ? 凯式定氮法：将蛋白质样品消化，测定其无机氮量，由此计算出蛋白质含量，反应灵敏准确，操作复杂，一般用来标定标准蛋白质。 ? Folin法：包含双缩脲反应和酚试剂反应，反应灵敏，但干扰因素多，是当前生化实验室常用的蛋白质定量测定的方法之一。 ? 考马斯亮蓝法：利用考马斯亮蓝染料于蛋白质结合的原理，灵敏度高，缺点是在标准蛋白较大时标准曲线弯曲。 ? BCA法：在碱性溶液中，蛋白质的肽键与Cu2+生成络合物，同时将其还原成Cu+，BCA特异地与Cu+结合生成紫色复合物，此方法灵敏，操作简便，试剂稳定。 双缩脲 Cu2+-蛋白质络和物 第二步反应 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸等组成，在酸性条件下较稳定，在碱性条件下易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此方法也适用于测定酪氨酸、色氨酸含量的测定。 此方法是在Lowry等人在酚试剂法的基础上引入了双缩脲反应，使反应灵敏度提高，由蛋白质氨基酸组成引起的偏差减小。Lowry法灵敏度高，操作简便，但干扰因素较多，在测定之前应排除干扰因素或做空白实验消除。 0.25 2.5 0.45 0.05 — 7 A640nm A640nm(2) A640nm(1) 迅速混匀，室温放置30min后，以dH2O为空白，在640nm处比色 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 乙试剂/mL 混匀，于室温放置10min 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 甲试剂/mL 0.47 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 dH2O/mL 0.03 — — — — — — 待测蛋白质溶液/mL — 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 标准蛋白质溶液/mL 6 5 4 3 2 1 0 3. 计算谷胱甘肽转硫酶的比活力：根据酶液的蛋白质含量和测定酶活力时所用的酶液体积，计算出测定酶活力所用蛋白质的量，进而计算出酶的比活力。