荧光PCR原理荧光染料荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰在.PDFVIP

中国试剂网 3.12.7.18 荧光PCR 原理 1．荧光染料 荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量 后通常以三种方式释放出能量： 1) 光能 许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值 大于吸收峰。比如荧光染料Fam 的光吸收峰为490nm ，而发射峰为530nm。 2) 热能 某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如Dabcyl 。 3) 转移给临近的分子 当临近的分子满足发生能量转移的要求时，能量从荧光基 团传递到临近的分子。 2 ．荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer ，FRET ） 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离 足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的 荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基 团释放的荧光屏蔽。 3 ．荧光PCR 荧光PCR 不同于其他PCR 的地方在于PCR 过程中利用荧光染料在光刺激下释 放的荧光能量的变化直接反映出 PCR 扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增 产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到 对原始模板量定量的目的。主要有以下几类： 1) 荧光染料直接结合扩增产物 如SYBB Green I,类似于EB,能特异性地区分单 双链DNA,只与双链DNA 结合. 2) 荧光标记引物 对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入 PCR 扩增 产物. 3) 荧光标记探针 常规引物以外，引入荧光基团标记的特异性探针，探针可与模 板发生一对一结合关系。 a) Taqman 双标记探针（TaqmanTM 5-nuclease assay ） b) 分子信标探针（Molecular beacon TM ） c) LightCycler TM 杂交双探针 荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强，避免了非特异性扩增造成的假阳 中国试剂网 3.12.7.18 性信号。 匹基生物开发的荧光 PCR 检测试剂盒主要基于 Taqman 技术 (TaqmanTM 5-nuclease assay) ：除常规的一对引物以外，PCR 反应体系中另加有 一个能与PCR 产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5 端标记一个荧光基团，3 标记另一个荧光基团。此时5 端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧 光淬灭基团（发生 FRET ），因此正常情况下检测不到该探针5 端荧光基团发出 的荧光信号.但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与 模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换: Taq 酶的5—3’外切酶活性将探针5 端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反 应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧 光基团数与PCR 产物的数量成比例。因此根据PCR 反应液的荧光强度即可计算 出初始模板的数量 4 ．荧光定量PCR （Fluorenscent Quantitative PCR,FQ-PCR ） 1) Threshold：PCR 扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S 型 扩增曲线的增长拐点处附近。 2) Threshold Cycle (TC or CT) OR Cross Point(CP) ：PCR 增长信号与Threshold 发 生交汇的循环数，也是FQ-PCR 判断阴阳性和进行定量分析的依据。 3) Standard Curve(标准曲线) ：CT/TC/CP 与起始模板量的对数呈反比关系： Y=-aX+b 其中X=Log Concentration Y=CT/TC/CP PCR 扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增， 利用该系列模板的CT/TC/CP 值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而 计算出未知样品的起始模板浓度。 5 ．荧光PCR 的优点