共聚焦2010讲解材料.ppt

多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子 牛精子 绿色：MitoTracker Green 紫色：Hoechst 33342 Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer–1 ，染核 绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白 牛肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488 染肌丝蛋白 藤黄微球菌 绿色：活菌 红色：死菌 染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖叮橙染色 绿色为DNA 红色为RNA 激光共聚焦显微镜的优势 在结构方面 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小 在应用方面 形态观察--高清晰成像 半定量--荧光强度分析 荧光探针表达量测定 定位研究--分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等 激光共聚焦显微镜的优势 在效果方面更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 显微镜 扫 激光共聚焦显微镜的优势 定量测量： 静态的定量测量 对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。 动态的定量测量 共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。 激光共聚焦显微镜的优势在效果方面 快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存： 用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。 激光共聚焦显微镜的优势在效果方面 鼠成纤维细胞 单克隆anti–β-tubulin 标记 高清晰成像 检测人类癌细胞表皮生长因子 高清晰成像 涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 鬼笔环肽 高清晰成像 培养的293细胞绿色荧光蛋白 高清晰成像 培养的人肝癌细胞哑叮橙染色 高清晰成像 透射光扫描（DIC） 利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 树突状细胞 培养细胞 半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。 随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。 半定量荧光强度分析 随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值 半定量荧光强度分析 获得数据的TXT文件 将TXT文件导入EXCEL进行统计分析 荧光表达量测定 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 荧光表达量测定 分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 分层扫描（切片扫描） 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 入射光 被检测层面 整个样品 白光（不能透过） 发射光 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数