第3章--细胞生物学研究方法介绍(翟中和第四版).ppt

目前实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 人 BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PC12 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 一、细胞培养——植物细胞培养 单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通 过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株 一、细胞培养——植物细胞培养 原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株 二、细胞工程 （一）细胞融合与单克隆抗体技术 细胞融合 灭活的病毒 化学物质（如PEG） 电融合 同核体（homokaryon） 异核体（heterokaryon） 合核体（synkaryon） 单克隆抗体与多克隆抗体 单克隆抗体的制备 （二）显微操作技术与动物的克隆 细胞拆合：胞质体，核体 物理法：机械法或短波光 化学法：细胞松弛素 显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等 克隆羊多莉的培育 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 Martin D N , Baehrecke E H Development 2004;131:275-284 一、荧光漂白恢复技术 亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联 高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭 由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复 测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率 fluorescence photobleaching recovery， FPR Figure 10-36a Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008) 二、单分子技术与细胞生命活动的研究 指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、相互识别等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等 use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesin Fluorescent image of single motor proteins (left): Motion of two diffusing kinesin molecules (green) on a microtubule (red) shown as a time series kymograph. Schematic (right): By dragging diffusing kinesin molecules with laser tweezers over a microtubule, the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely 三、酵母双杂交技术 在体内分析蛋白质－蛋白质相互作用 利用转录激活因子的DNA 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理 四、荧光共振能量转移技术(FRET) 分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0 (electronic ground state ) 的最低振动能级 吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这－过程发生在10-15s时间内 被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光 FRET产生的条件 D、A都能发荧光 D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠 D和A之间的距离必须小于10nm。 FRET 的基本原理 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用 如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光 两个蛋白未相互作用 相互作用 五、放射自显影技术 利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究 两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示 根据实验要求选择合适的同位素 研究DNA 合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR 研究RNA 合成用3H-U 在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸 对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：持续标记、脉冲标记 显微放射自显影 电镜放射自显影 胰岛B细胞电镜放射自显影结果 3H-亮氨酸脉冲标记完成10