细胞试验技巧及基础常识[要略].docVIP

  1. 1、本文档共15页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  5. 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  6. 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  7. 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  8. 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
细胞试验技巧及基础常识[要略]

一.细胞培养技术 细胞周期的测定 一、原理 ???? 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 ??单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。 ??测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。 ??BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器、用品:同常规细胞培养 2、试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液 三、操作步骤 1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml。 2、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。 3、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。 4、常规染色体制片(见第三部分:染色体技术)。 5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。 6、弃去2×SSC液,流水冲洗。 7、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。 8、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 9、计算:?细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时) 附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml?? 4℃下避光保存。 ?? (2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠·2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。 细胞的冻存和复苏 一、原理 ????在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 ??细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。 ??目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。 二、操作步骤 (一)冻存 1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。 4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。 ??注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,绝对不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1~1.5月。 (二)复苏 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。 4、1000rpm离心10分钟,弃去上清液。 5、沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。 6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。 三、试剂和器材 器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等 试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液) 附:冻存液配制: 培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。 细胞系或细胞株的建立 一、概念 ???? 1、细胞系(Cell Line):原代培养舞经首次传代成功即成细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系(Lineage of Cells)所组成。 ???? 2、细胞株(Cell Strain):通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限,称为有限细胞株(finitecell strain);如果可以连续传代,称为连续细胞株(continuous cell

您可能关注的文档

文档评论(0)

zhuliyan1314 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档