练习进行细胞计数并用细胞计数法绘制生长曲线.ppt

【实验目的】 1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长曲线，以了解培养细胞的生长发育特性 2．掌握测定细胞活力的方法 细胞计数及活力测定 Experiment 18 【实验目的】 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 【实验材料】 一、材料：细胞悬液。 二、器材：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计） 三、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 （1）0.4%台盼兰染液配制：?台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。 （2）MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。 （3）酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。 【实验内容】 1．细胞计数 ①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 ③静置3分钟。 ④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝（4大格细胞总数/ 4）×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 3．MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 ①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 ③37℃下保温2小时。 ④加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 ⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 【注意事项】 1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。 2．MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。 【作业与思考题】 1．根据实验结果，画出生长曲线。 2．试述用MTT法测定细胞生长曲线的过程及注意事项。 3．细胞接种的密度与细胞生长曲线的测量结果之间有什么关系？ 4．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？