HPLC基本理论.pptVIP

HPLC分离条件的选择 李 玲 2001.12 分离度(R)与柱效(n)、分配系数比(?)及容量因子(k)的关系 n1/2 ?-1 k R = · · 4 ? 1+k 柱效 选择性 容量因子 影响分离度的因素 1. 柱效： 柱效与填料颗粒度大小、形状、平均粒度和填充技术有关（主要影响到A值）。 分离度的计算： tR2 - tR1 R = 2 W1+ W2 如何改善分离度 选择合适的色谱柱； 选择合适的流动相组成和配比； 选择合适的pH值； 选择合适的色谱柱柱温； 选择合适的流动相流速。 色谱分析工作中常见问题 基线噪音可能的原因 检测池脏； 检测池灯能量下降； 由泵引起的脉冲； 检测器上温度效应； 检测池中有气泡通过。 基线飘移可能的原因 梯度洗脱引起； 温度不稳定(特别是用示差折光检测器时)； 流动相脏； 柱子没有用流动相平衡。 柱外扩展 用短而窄的管路连接进样器、色谱柱、检测器; 确认所有连接管接头都匹配； 使用死体积小的流动池； 减小进样量。 双峰 柱床塌陷或柱床运动； 泵头过滤芯部分堵塞； 组分共流出。 峰扩展 柱效降低或有柱塌陷； 进样体积过大； 流动相粘度大 前一次样品的流出物； 高分子量样品或聚合物。 拖尾 二次洗脱效应； 残留硅醇基的相互作用； 小峰在大峰后洗脱出来。 柱外效应和柱子失效； 柱头有污染物堆积； 重金属反应。 前伸峰 柱子过载； 小峰在大峰之前洗脱出来。 负峰 样品峰比流动相吸收小； 溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏； 在示差折光检测器中最常见。 HPLC操作注意事项 分析前的准备工作 使用HPLC级溶剂做流动相； 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌； 用滤膜过滤溶剂去除微生物和杂质； 每两天更换或过滤溶剂； 避免溶剂瓶直接日照。 分析前的准备工作 未装脱气装置的仪器，流动相应预先脱气后再使用； 分析不同的样品时，进样阀阀口要进行清洗，以避免交叉干扰； 溶剂配比时，要注意溶剂之间的相溶性。 色谱柱的保护 溶解样品最好使用流动相，或使用与流动相极性相近的溶剂，以避免被分离组分在柱中沉积； 流动相加有缓冲液时，每天关机前应及时用纯溶剂冲洗，以避免缓冲液腐蚀流路和破坏固定相结构； 分离不纯净样品时，一定要安装保护柱，以避免污染物对色谱柱的损坏。 柱子不使用时，短期内可两端密封保存，若长期不用，应保存在适当的溶剂中； 不要高压冲洗色谱柱； 不要高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 注意色谱柱的pH使用范围（0?8），pH9硅胶容易溶解。 当色谱条件转换时(如从正相?反相)，应使用过渡溶剂冲洗流路，以避免由于色谱条件的转换，造成洗脱剂之间不相溶，从而引起色谱柱失去平衡。常用的过渡溶剂有：异丙醇、甲醇、乙腈等。 使用紫外检测器时，应注意流动相的检测极限，以避免基线飘移无法正常检测。 对不锈钢有腐蚀性的溶剂 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液，如：氯化钠溶液、盐酸溶液等； 高浓度的无机酸，如：硝酸和硫酸等； 有机酸溶液，如：甲酸、乙酸等； 含有强络合剂的溶液； 四氯化碳和异丙醇或四氢呋喃的混合液。 用外标法定量时须注意： 采用定量环定量，进样量应为定量环的3?5倍； 采用注射器定量，进样量应为定量环的50%。 常用溶剂的紫外吸收波长 乙腈 190nm 乙醚 220nm 水 190nm 二氯甲烷 220nm 环己烷 195nm 氯仿 240nm 己烷 200nm 四氯化碳 265nm 甲醇 210nm 四氢呋喃 280nm 乙醇 210nm 甲苯 280nm * * 柱效对峰形的影响 2. 容量因子： k = Ws / Wm k 与溶剂洗脱强度密切相关 容量因子对分离的影响 3. 选择性： ? = kB / kA 流动相的组成、配比和pH值，不同固定相的色谱柱和分析温度，均可影响色谱分离的选择性。 选择性参数?对分离的影响 柱温对分离的影响 R = 1.5可以达到基线分离 不同分离度的色谱峰重叠情况 不同分离度的色谱图比较 上图：所有峰都扩展 下图：部分峰扩展 上图：部分峰拖尾 下图：所有峰均拖尾 溶剂过滤 不干净的溶剂或在溶剂瓶中