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利用CTL表位替换方法构建新型乙肝疫苗
利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换(
王文敬1,黎诚耀1,李明松2(南方医科大学:1.生物技术学院, 2.南方医院消化科,广州510515)
摘 要目的(glypican-3,GPC3)的CTL 表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗。以为模板,应用重叠延伸PCR 扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因 HBsAg,将其插入pBSK+载体中,构建出pBSK/GPC3载体。,利用DNA 重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+真核表达载体经酶切和测序鉴定构建表达表位EYILSLEEL。结果了表达EYILSLEEL真核pcDNA3-GPC3/HBsAg。结论 成功构建pcDNA3-GPC3/HBsAg真核表达。
关键词表位重叠延伸PCR WANG Wen-Jing1, LI Cheng-Yao1 ,LI Ming-Song2(1School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Dept.of gastroenterology, Nan Fang Hospital, Guangzhou 510515, China)
Abstract Objective This paper was to make a HBV vaccine by replacing CTL epitope of HBsAg with EYILSLEEL of GPC3 antigen. Methods The GPC3/HBsAg DNA was amplified by SEOing PCR from pcHBsAg plasmid and linked into pBSSK+ vector to construct pBSSK/GPC3 vector. pBSSK/GPC3 vector was identified by PCR, double digesting and sequencing. Then the fragment with GPC3 CTL epitope EYILSLEEL was obtained by double digesting the plasmid pBSSK/GPC3 and then inserted into pcDNA3.1+ vector. Results Sequencing is correct. Eukaryotic expression vector pcDNA-GPC3/HBsAg was constructed successfully. Conclusion The construction of eukaryotic expression vector pcDNA-GPC3/HBsAg provided a solid experimental foundation for further studies on the GPC3-HBsAg multiple peptides vaccine for HBV infection.
Key words: epitope shift; glypican-3; CTL epitope; SOEing PCR
SOEing(gene splicing by overlap extension) ,即重叠区扩增基因拼接法,PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法[1] 。众所周知,,5’端序列不必与模板完全配对,5’端可以添加一种甚至是2种酶切位点,以便于后期克隆。SOEing 法正是利用这一特点,,3’[2,3]。
乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗无需免疫佐剂即能诱导出高效而特异的细胞免疫和体液免疫HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性,本身不能复制,无感染性探索以特异性的外源基因插入或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性的内源CTL表位在体内诱导出高效而特异的细胞免疫,目前正成为全球研究的热点。HBsAg这种新型载体,针对肿瘤病原体的为一种安全、有效的工具,。1 材料与方法
1. 1 材料 和质粒α菌种为本实验室保存真核表达载体、dNTP和限制性内切酶Not、及T4 DNA 连接酶购自 公司引物由公司合成
1. 2 改进的FLG、LLD、SIL等CTL表位。3 引物 ’和3’端均包括EYILSLEEL表位序列。替换序列 5’引物WJF: TACATCCATGAGCCTGGAGGAGCTGGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCAGC;替换序列 3’引物WJR: CTCCTCCGAGGCTCAGGATGTACTCCACCAGCAGGAA
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