取对数生长期细胞.ppt

3.1.1 材料与设备器材的准备与消毒 按照实验要求，准备实验材料并进行消毒待用；实验设备预先调试，实验器材预先消毒。 准备卡片记录需用器材和物品名称、要求及数量等，实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全而往返拿取时增加污染机会。 3.1.2 超净台和培养室的消毒 超净台实验前用70%酒精消毒，配合紫外线灭菌灯(每次开启15min以上)等消毒灭菌。 注意：在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿放置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响（必要时可用纸张覆盖）。 无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用0.1%新洁尔灭抹拭台面和用具（70%酒精也可），用福尔马林（40%甲醛）加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯（每次开启15分钟以上）等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。 3.1.3 洗手与着装 无菌的实验服，帽子和口罩，有时还要准备无菌手套。服装平时用紫外线照射消毒。 进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。 实验操作前，出入无菌室，接触污染物等情况下要以75%酒精（或0.1%新洁尔灭）洗手和前臂。 3.1.4 无菌操作 1、在无菌环境进行无菌操作时首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。 已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。 无菌操作（续） 2、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。 升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上， 二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。 升汞处理方法：  升汞＋Na2S－－－絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）－－＋FeSO4（中和过多的Na2S ）。 无菌操作（续） 为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局. 原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。 无菌操作（续） 工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。 培养液在未用前，不要过早开瓶；用后如不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开瓶以后，应保持45 度斜位或平放，开口向上长时间直立可增加落菌机会。 无菌操作（续） 吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。 工作中不能面向操作台讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 无菌操作（续） 3、实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10 min后，才可进行下一个实验操作。 无菌操作（续） 4、超净工作台的操作规程。 4.1 超净工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不变。 4.2 每月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器，改 变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 4.3 上班前，清洁工人必须对工作台周围环境进行清洁工作，对空气进行净化处理。 4.4 操作人员进入超净工作区前，必须在缓冲间穿衣、裤，戴帽子、手套等，并尽量避免作明显扰乱气流流型的动作。 4.5 使用工作台时，应提前 50min 打开紫外线灭菌灯处理净化工作区工作台表面积累的微生物，30min 后关闭灭菌灯，启动送风机。 4.6 工作完毕后，0.1%新洁尔灭擦拭净化工作台面，关闭送风机，打开紫外灯灭菌 30min， 最后关闭电源。 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中。 整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 3.2.1 培养细胞的观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。 细胞计数方法 原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每ml细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。 2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡