《层析分离纯化技术-课件》.ppt

层析分离纯化技术 蛋白质纯化策略 简易纯化选择 GST 融合蛋白的纯化 任何规模纯化都比较简单 GST MicroSpin? Purification Module 立即可用, 50 预装柱含缓冲液和所需试剂 可纯化每柱 400 μg, 体积达400 μl 样品 GSTrap? 柱 20 分钟内 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg 使用针筒，蠕动泵，或者 ?KTA? 系统 添加剂兼容 GSTrap? GSTrap? Glutathione Sepharose? Fast Flow 适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大 GST 融合蛋白的检测 GST融合蛋白的检测 GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒 快速酶测定 每块板可检测 50 样品 适合筛选表达系统和层析组份 (His)6 融合蛋白的纯化和检测 任何规模纯化都比较简单 His MicroSpin? 纯化模组 立即可用, 50 预装柱连缓冲液和试剂 每柱可纯化达 100 μg, 体积达 400 μl 样品 HisTrap? Kit 每根 HiTrap? Chelating 金属螯合柱可在少於 25 分钟中纯化 12 mg 融合蛋白 包含所需浓缩缓冲液和工具 使用针筒，蠕动泵，或者 ?KTA? 系统 添加剂兼容 HiTrap? Chelating HiTrap? Chelating Chelating Sepharose? Fast Flow 适合自行装柱和放大 检测 (His)6 融合蛋白 检测 (His)6 融合蛋白 其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (1/3) 如果有对应配基，使用亲和层析 一步纯化 高灵敏度 高载量 其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (2/3) 其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (3/3) 其他融合 或 非融合蛋白的纯化 准备配基 (e.g. 抗体) 准备柱子 (e.g. NHS-activated HiTrap?) 现成方法 优化结合和洗脱条件 使用针筒，蠕动泵，或者 ?KTA? 系统操作的 HiTrap 小柱 其他融合 或 非融合蛋白的检测 去处小分子 纯化后 (His)6 融合蛋白的咪唑 酶切后的 GST 或 His 标记 多余的盐/尿素/盐酸胍 用 HiTrap? Desalting 将样品转移到另一种缓冲液中，e.g. 储存用或改变 pH 交换缓冲液和去盐的柱子 快速有效 高处理量 去盐, 交换缓冲液, 去掉低分子量物质 交换缓冲液和去盐的柱子 选择纯化设备 选择纯化设备 多步纯化 (非融合性蛋白或需要更高纯度) 工艺开发和优化 法规需要 e.g. GLP/GMP 纯化工艺放大 转移工艺到更大规模 大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融合蛋白的扩增，纯化和复性 详细步骤 过程 包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离 每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris? -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4oC下高速离心 10 分钟 重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在+4oC下高速离心 10 分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物 溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.): 20 mM Tris? -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 准备 HiTrap? Chelating 柱 冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tris? -HCl, 5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱 纯化和复性 组份分析 多维蛋白质纯化 高效纯化策略 减少处理步骤 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 样品准备 考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品 三步纯化策略 三步纯化策略 三步纯化策略 三步纯化策略 粗提 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 粗提: 离子交换填料 粗提: 疏水层析填料 高载量 高流速 HiPrep? 16/10 Phenyl (高 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16