大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取工艺优化1.doc

大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取工艺优化 周强，解江，饶秀平，郭伟良* （海南大学海洋学院水产养学系, 海南 海口570228） 摘要：哈氏弧菌是常见的海水养殖动物病原菌之一，对海水养殖也造成严重的危害。大黄中含有抗哈氏弧菌的活性物质，本文在筛选最有效的提取方法的基础上，采用单因素方法初步优化从大黄中提取抗哈氏弧菌活性物质的提取条件，结果显示采用热水回流提取方法最佳，其最优的提取条件是浸润时间为1.0 h，提取时间为3.0 h，料液比为50 ml : 3.0g（v/g），经过优化后，大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取得率为优化前提高了12.6倍，大大提高抗哈氏弧菌活性物质的提取效率。 关键词：哈氏弧菌；大黄；提取工艺；优化 随着水产养殖规模不断扩大，生产集约化，养殖环境恶化，养殖病害频发[1-3]。哈氏弧菌（vibrio harveyi） （1） 将大黄提取液母液分别稀释成0.0100、0.0063、0.0045、0.0036、0.0030和0.0025 g/ml，按照（3）的方法测定各标准液的抑菌圈直径，以提取液浓度对数作为横坐标，抑菌圈直径作为纵坐标，绘制标准曲线。 （5）样品的测定，将样品液稀释致合适浓度，按照（3）方法测定其抑菌圈直径，根据（4）的标准曲线计算其活性物质浓度，然后计算活性物质提取得率。 1.2.3 提取方法的选择 超声波法：称取5 g粉末于ml的中，然后加5ml水， 回流提取：称取g大黄样品，置于圆底烧瓶中，加入50ml去离子水，回流提取1h； 索氏提取：称取g的大黄样品，用滤纸包成圆筒状，装入索氏提取器中，在圆底烧瓶中加入0 ml去离子水，提取2 h，收集提取液； 热水：称取g的大黄样品于250 ml锥形瓶中，加入50 ml水，浸润0.5 h，置于沸水浴中提取1 h； 微波提取：称取1g的大黄样品于250 ml锥形瓶中，加入50 ml水，浸润0.5 h，置于微波炉中提取10in，提取结束后，8000rpm离心10min，取上清液待用。 1.2.4 单因素法优化提取条件 按照1.2.3方法，筛选大黄中抗哈氏弧菌活性物质的最佳提取方法，然后采用单因素试验方法，即固定其它提取条件，但改变其中的一个条件，找到该条件的最优值，如此顺序优化，知道所有提取条件找到最优值。 2 结果与讨论 2.1 琼脂扩散法测定大黄提取液抗哈氏弧菌的体外抑菌活性结果 按照1.2.2方法测定大黄提取液抗哈氏弧菌的体外抑菌活性，其抑菌效果如图1所示，由图可以看出，大黄提取液对哈氏弧菌的抑制形成正圆形，边缘清晰，方便精确测量，表明该方法可行。 图 1 大黄提取液抗哈氏弧菌的体外抑菌图 Fig.1 ??????? 2.2 标准曲线绘制结果 按照1.2.2（4）方法绘制大黄提取液浓度对数与抗哈氏弧菌的体外抑菌圈直径间的标准曲线，结果如图 2所示，曲线方程为Y=7.203X+24.39，曲线的R2=为0.9962，表明大黄提取液浓度对数与抗哈氏弧菌的体外抑菌圈直径间有较好的相关性，应用曲线计算活性物质浓度是可行的。 2.3 提取方法的筛选结果 按照1.2.3方法，分别考察了超声波提取法，回流提取法、索氏提取热水微波提取图 2 大黄提取液浓度对数与抗哈氏弧菌的体外抑菌圈直径间的标准曲线图 Fig.2 ??????? 图 3 不同提取方法对大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取得率的影响 Fig.3 ??????? 2.4 单因素优化回流提取法提取条件 2.4.1 浸润时间的优化 按照1.2.3方法的回流提取方法进行大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取，回流时间固定为1h，液料比固定为5g : 50ml(g/v)，分别考察浸润时间为0.5、1.0、1.5和2.0h时对抗哈氏弧菌活性物质的提取得率的影响，结果如图4所示，由图可以看出，在浸润时间为1.0 h时，抗哈氏弧菌的活性物质提取得率最高，故选择浸润时间为1.0 h。 2.4.2 提取时间的优化 按照1.2.3方法的回流提取方法进行大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取，回流浸润时间采用2.4.1的优化结果，固定为1.0 h，液料比固定为5g : 50ml(g/v)，分别考察提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3、4和5 h时对抗哈氏弧菌活性物质的提取得率的影响，结果如图5所示，由图可以看出，随着提取时间的增加，抗哈氏弧菌活性物质的提取得率在不断增加，在达到3.0h时达到最高，在增加提取时间时，提取率反而下降，这可能是由于长时间高温提取对活性物质造成破坏引起的，因此选择最佳的提取时间为3.0 h。 图 4 浸润时间对大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取得率影响 Fig.4 ??????? 图 5 提取时间对大黄中抗哈氏弧菌活性物质提取得率影响 Fig.5 ??????? 2.