悬浮与贴壁洗胞培养观察.ppt

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悬浮与贴壁洗胞培养观察

实验三 悬浮细胞与贴壁细胞 的培养与观察 细胞培养的基本概念 细胞传代: 细胞在培养器皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培养器皿中。 细胞系 cell line 细胞株 cell strain 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长: 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长: 于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期(平台期) 游离期: 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态.也称悬浮期。此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期: 细胞附着于底物上,游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白(生长基质),这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基团) 潜伏期 此时细胞有生长话动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期一 般为6~24小时。 对数生长期: 细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。 停止期(平台期): 细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂 机制:接触抑制、密度依赖性 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒 实验准备 实验用品: 超净工作台,压力蒸汽消毒器,电热干燥箱,滤器,酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器,纯水仪 耗材:培养瓶,吸管,电动吸引器,培养板, 冻存管 压力蒸汽消毒器:湿热消毒,用途广 电热干燥箱:干热消毒(160 ℃ ,2小时)。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台:为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 :紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台 滤 器 CO2培养箱 培养瓶 常用玻璃器皿清洗 浸泡(自来水)、刷洗(洗衣粉)、酸泡(24小时)、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 清洁液的配制 2 细胞培养用液的配制 水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 消化液: 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25% 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。 天然培养基: 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限。 成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC1

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