细胞工程试验室及基本技术.pptVIP

细胞工程实验室及基本技术 实验室及仪器设备 实验基本操作 清洗 消毒灭菌 无菌操作 培养基及其配制 接 种 培养条件控制 小结 接 种 室 细 胞 学 实 验 室 理 化 分 析 实 验 室 仪 器 设 备 基 本 设 备 灭 菌 设 备 光照培养设备 清 洗 新购置的玻璃器皿 常有游离碱性物质，使用前，先用1%稀盐酸浸泡过夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，晾干备用。 已用过的塑料器皿 冲洗干净，先用2%NaOH浸泡过夜,然后清水冲洗,再用2%~5%HCl浸泡30min,清水冲洗,最后用蒸馏水冲洗一遍,晾干备用。 新的金属器皿 用热洗衣粉水洗净,冲洗后擦干即可。 已污染的培养器皿 需在高压蒸汽灭菌后清洗。 除菌过滤器 用清水冲洗后,用清洁液冲洗,再用清水冲洗,最后用蒸馏水冲洗,晾干备用。 消毒灭菌 培养材料的消毒灭菌 培养基的消毒灭菌 玻璃器皿、塑料器皿和器械的消毒灭菌 无菌操作室的消毒灭菌 方法 物理方法 化学方法 干热灭菌法 消毒剂消毒法 湿热灭菌法 抗生素灭菌法 过滤除菌法 射线消毒灭菌法 培养材料的灭菌 外植体取材 外植体(expant)是指用于离体培养的活的植物组织。 来源： 外植体取材原则： 1. 根据培养需求选择植物部位 2. 多年生植物注意树龄和季节 3. 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体 外植体灭菌的过程流水冲洗10~20min 表面消毒 无菌水冲洗4~5次 沥水待用 Flash 培养基灭菌 无菌操作 无菌操作前的准备工作 操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。 无菌操作步骤 自然条件下生长的外植体 继代培养的材料(液体材料、固体材料） 污染源及其表现特征 细菌（黏液或混浊的水迹） 真菌 培 养 基 培 养 基 培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质,是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。 营养基质在生物体内的生理作用有以下4方面： 组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质 构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢 元素间互相协调，维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。 调节形态发生和组织器官的建成。 培养基种类及配方 到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的。这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下： 培养基分类 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下4类： ①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）； ②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）； ③中等无机盐含量培养基（花药培养）； ④低无机盐含量培养基（生根）。 培养基成分 培养基成分 无机元素 无机营养成分对植物的生长发育十分重要 无机元素在水中溶解时发生解离，形成离子所以植物组织从培养基中吸收的元素是离子态形式。 无机离子供应的过量，会对植物生长产生毒害作用。 培养基成分 有机元素 氨基酸类 重要的有机氮源 维生素类 以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用 糖类 主要的碳源 天然有机添加物类 CM（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等 培养基成分——生长调节物质 生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。 常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA IAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；诱导分化则用NAA、NBA或IAA。IBA诱导生根效果最好。 细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老。 常用的有6-BA、 KT 、 ZT 培养基成分——生长调节物质 赤霉素类 主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。 脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。 乙烯 植物培养基及其配制 培养基母液的配制 大量元素一般配成10倍浓度的母液； 微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液； 混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀； 生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进