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1 酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System 酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种分子生物学方法。该方法在研究蛋白质组学领域有重要地位和作用。 传统的检测蛋白质相互作用的方法 蛋白质亲和层析 （protein affinity chromatography） 2. 亲和印迹（affinity blotting） 3. 免疫沉淀（immunoprecipitation） 反映的只是蛋白的体外相互作用 2 蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。近年，随着分子生物学技术的发展，人们对基因的结构和功能的认识不断加深，尤其是基因组研究的飞速进展，为揭示生命的奥秘提供了条件。然而，只凭借基因序列很难认识蛋白质的功能及在整个细胞中所处的位置和作用。由于蛋白质相互作用的复杂性，使得这方面的研究工作进展缓慢。最近兴起的双杂交系统为研究蛋白质的相互作用提供了一套崭新的方法。 酵母双杂交系统的基本原理 ? A The DNA-BD/protein X (bait) hybrid binds to the GAL1 UAS but cannot activate transcription without the activation domain (AD). In the absence of bait protein, the AD/library fusion protein cannot bind to the GAL 4 UAS and thus does not activate transcription. B Interaction between the bait and library proteins in vivo a activates transcription of The reporter gene. ? C 构建诱饵蛋白质粒(BD质粒) ↓ 检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续) ↓ 文库质粒(AD质粒)转化带有BD质粒的酵母菌，铺 SD/四缺平板 ↓ 挑his+、ade+双阳性克隆作β-galactosidase分析，消除假阳性 ↓ β-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒 ↓ 传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒 ↓ 检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续) ↓ AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用 ↓ 阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询 ↙ ↘ 如果找到候选蛋白，克隆其 如果找不到候选蛋白，有可能 全基因，采用GST融合表达 是新基因，可进一步分析，设 技术和体外翻译技术在蛋白 计引物，克隆全基因并进一步验证 ↓ 基因在真核细胞中的表达及定位分析 ? 图三 双杂交系统文库筛选过程流程图 双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的[1]。它的建立是基于对真核生物掉空转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子，例如酵母转录因子Gal4，在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成。其中有DNA结合结构域（DNA bonding domain, DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain, DNA-AD〉。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但是不能激活转录，只有当两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（uostream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 天然Gal4分子由一条多肽链组成，含881个氨基酸。它有两个结构域：DNA结合域（DNA-binding domain, DB），由位于N-末端的1~147个氨基酸构成，能够识别位于 Gal1 基因的上游激活序列（upstream activating