流式细胞术系列之-DNA倍体和细胞周期分析.pptVIP

DNA倍体和细胞周期分析 细胞周期和DNA倍体分析的原理 G0/G1期DNA含量为2C S期细胞,DNA含量开始增加,2C G2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C 1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2、性细胞DNA含量为1C 3、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至4C 4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C * 细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量 Diploid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23 G0/G1 S G2/M * DNA检测的常用术语 表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。 通常由G0/G1峰的CV来反映【 %CV=（SD/mean）x 100】。 影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。 1. 变异系数（Coefficient of Variation，CV） * DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。 DI为1 意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。 倍体（Ploidy）：原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。 2. DNA指数（DNA index，DI）和倍体（Ploidy） DNA检测的常用术语 * Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21 Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19 * 可检测标本 新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。 冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织 常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。 蜡块包埋的标本需进行特殊处理 * DNA异倍体染色操作程序 （BD 公司试剂盒 Cat.No. 340242） A液：含有胰蛋白酶、四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织，消化细胞膜及细胞骨架 。 B液：含有胰蛋白酶抑制剂、RNA酶、柠檬酸盐缓冲液、四氢氯化精胺。用于抑制胰蛋白酶的作用并消化RNA 。 C液：含有PI染液、四氢氯化精胺、柠檬酸盐缓冲液。PI作用时的最终浓度至少有125ug/ml 缓冲液含有柠檬酸钠、DMSO，用于收集和（或）冷冻细胞悬液 。 1、试剂盒组成： * （1）血液或骨髓：取全血100微升或骨髓50微升，加FACSLysing溶血液1ml，置室温10min, 1500rmp离心5min，弃上清，生理盐水2ml洗涤细胞2次。然后，可以直接按试剂盒说明书进行染色；也可用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放。 （2）胸水、腹水等组织液：取适量液体，1500rmp离心5min，弃上清液，获取细胞（如混有过多的红细胞，可以用FACSLysing溶血液进行溶血），同上处理。 （3）固体组织：小块组织，可以放入200目尼龙网袋中，用注射器针芯碾磨；大的组织块，可用剪刀将组织剪为肉糜状，加适量生理盐水，置试管中，垂直放置数分钟，待大块组织下沉后，吸取上层细胞悬液，生理盐水2ml洗涤细胞2次。直接进行染色，或用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放。 标本处理 * 将上述处理的细胞（约 5~10×105）悬起，加A液250微升，轻轻混匀，置室温10min。 加B液200微升，轻轻混匀，置室温10min。 加C液200微升，轻轻混匀，置室温，避光10min。 200目尼龙网过滤到相应的流式管。 2小时内上机检测。 染色过程 * 注意事项 1、需较长时间存放的标本可用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放； 2、一般组织或体液均为混合细胞成分，含有一定量的二倍体细胞，可以作为内参照。如分析的细胞来自纯肿瘤组织，应加入一定量的正常PBMC做二倍体对照； 3、每次分析前，用DNA质量控制试剂盒