沈萍微生物学第十章讲.ppt

;一、历史回顾 40年代－－明确DNA是遗传物质 50年代－－DNA双螺旋模型，半保留复制 60年代初－－中心法则，操纵子 70年代;关键性实验技术突破;基因工程的定义;基因工程的基本过程 （1）目的基因的获得 动物，植物，微生物中提取 反转录mRNA cDNA 化学合成 （2）优良载体的选择 一个复制子,能大量增殖 分子量比较小 多种酶单一切点 有选择性标记 原核生物－－质粒，噬菌体， 真核生物－－SV40 (动物），Ti (植物）.;（3） 目的基因与载体DNA体外重组 限制酶切割产生黏性末端，人工接头 低温退火 在连接酶作用下共价结合－－杂种分子 （4）重组载体导入受体细胞 转化－－－质粒 转导－－－噬菌体 （5）重组受体细胞的筛选与鉴定 遗传学方法：插入失活双抗生素对照筛选 免疫学方法：用抗血清;转化E.coli;插入失活双抗生素对照筛选 ;;三、微生物与基因工程的关系;基因组文库;; 通过一系列酶催化作用，使总poly(A)mRNA转变成dsDNA群体并插入到载体中，转化大肠杆菌细胞，即构成包含所有基因编码序列的cDNA文库 ;;二、基因的化学合成; 三、PCR 扩增基因 PCR－聚合酶链式反应 一种 体外快速扩增靶DNA技术 一， 基本原理： 与体内DNA复制基本原理相似 95 ℃ 变性 dsDNA ssDNA 55 ℃ 退火 引物与模板互补 72 ℃ 延伸 在引物3－OH加dNTP ;;四、基因的定位 诱变 1、寡核苷酸指导 的定位诱变;PCR定位诱变;第三节 微生物与克隆载体 一、质粒载体 pBR322质粒 多拷贝质粒 相对较小分子量仅4363bp 双选择标记 Amp, Tet Amp, Tet基因中有限制酶切点，可插入外源基因 ;;二、 λ噬菌体载体 有非必需片段可被外源DNA取代 能导入寄主，扩增 能通过噬菌斑检测 有cos位点可成环 优点：可克隆23Kb外源DNA，大于质粒载体 感染效率达100% 缺点： 克隆的外源DNA 受限 ;三、柯斯质粒载体 λ噬菌体 + 质粒 具λ噬菌体特性 具质粒载体特性 具高容量克隆能力 优点：可克隆35 — 48Kb外源DNA 可象质粒那样复制 ;作为载体的一般要求： 1. 松弛型质粒，自主复制，拷贝数高 2. 分子量小－－可携带更多的DNA 3. 有选择性标记－－便于筛选 4. 多种酶的单一酶切位点－－便于克隆 5. 易导入和安全性 克隆载体－－适宜于外源DNA在受体中扩 增的载体。 表达载体－－适宜于外源DNA在受体中表 达的载体。;克隆载体－－适宜于外源DNA在受体中扩增的载体 克隆载体的用途： 1. 用于保存和扩增片段小于2Kb的DNA 2. 构建cDNA文库 3. 可用于目的DNA的测序 4. 作为核酸杂交时的探针来源;第四节 微生物与基因工程工具酶 （1）限制性核酸内切酶 定义：是一类能识别和切割dsDNA分子种特定碱基顺序的核酸内切酶 命名： E co R Ⅰ;分类： Ⅰ 型－－无特异位点不产生特异片段。 Ⅲ 型－－切割点不在识别特异位点处。 Ⅱ 型－－分子量小，仅仅需Mg2+能识别和 切割dsDNA的特异序列，产生特 异性片段。 识别－－识别序列4－6个碱基，回文结构 功能－－产生黏性末端，平末端。;（2）DNA polyease ① E.coli polⅠ 5/ 3/ DNApol活性 5/ 3/ 外切酶活性 3/ 5/ 外切酶活性 Klenow片段 5/ 3/ DNApol活性 3/ 5/ 外切酶活性 测序，末端标记 ;②TaqDNApolyease 耐热的依赖DNA的DNApolyease,65KD 作用温度－－ 75－80℃ 也有5/ 3/端外切酶活性