全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书（中文版）.docVIP

全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 全血线粒体DNA萃取试剂是一种旨在通过化学溶解纯化血白细胞、物理或化学破膜及离心处理获得线粒体，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物血细胞中的线粒体核酸成分处理。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。 技术背景 线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突变分析是研究中必不可少的。 产品内容 溶血液（Reagent A） 毫升 清理液（Reagent B） 毫升 裂解液（Reagent C） 毫升 净化液（Reagent D） 毫升 强化液（Reagent E） 毫升 保存液（Reagent F） 毫升 破膜液（Reagent G） 毫升 去干扰液（Reagent H） 微升 酶解液（Reagent I） 微升 萃取液（Reagent J） 毫升 浓缩液（Reagent K） 毫升 助沉液（Reagent L） 微升 沉淀液（Reagent M） 毫升 纯化液（Reagent N） 毫升 缓冲液（Reagent O） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 净化液（Reagent D）、 去干扰液（Reagent H）、 酶解液（Reagent I）、 萃取液（Reagent J）和 助沉液（Reagent L）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于核酸操作的容器 15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备的容器 50毫升锥形离心管：用于血细胞处理的容器 涡旋震荡仪：用于混匀 4℃微型台式离心机：用于沉淀细胞和核酸 4℃超速离心机：用于分离细胞器成分 DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞 58℃恒温水槽：用于孵育反应物 实验步骤 白细胞分离 实验开始前，室温预热 血溶液（Reagent A），同时4℃预冷 清理液（Reagent B）。然后进行下列操作。 准备2个无菌的50毫升锥形离心管 轻轻混匀新鲜的EDTA抗凝的全血样品 分别移出5毫升全血样品到每个50毫升锥形离心管 分别加入毫升室温预热的 血溶液（Reagent A） 轻轻上下倾倒离心管5次，确保充分混匀 室温下（25℃）孵育4分钟，期间轻轻上下倾倒离心管数次（注意：肉眼可以观察到血液颜色由不透明红色到清澈红色的变化） 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽掉上清液，留下500微升液体，以防抽掉白细胞颗粒群 用手指轻弹离心管2至3下，使白细胞颗粒群松动 分别加入毫升预冷的 清理液（Reagent B），混匀细胞 2管50毫升锥形离心管合并为1管 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入毫升预冷的 清理液（Reagent B），混匀细胞 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g 小心抽去上清液，确保没有液体残留（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里） 白细胞线粒体分离 实验开始前，将试剂盒里的 净化液（Reagent D）冻融，然后移出毫升 净化液（Reagent D）和毫升的 裂解液（Reagent C）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为 裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作，根据用户要求选择其中一种方法： 方法一：细胞匀浆法 加入预冷的毫升 裂解工作液 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项11） 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物 方法二、化学处理法 加入预冷的毫升 裂解工作液 涡旋震荡5秒，充分混匀 在冰槽里孵育2分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒 加入预冷的微升 强化液（Reagent E） 涡旋震荡5秒，充分混匀 在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒（注意：参见注意事项12） 加入预冷