化妆品用化学原料体外皮肤变态反应直接多肽试验方法征求意见稿.pdf

化妆品用化学原料体外皮肤变态反应:直接多肽试验方法 （征求意见稿） 1 范围 本方法规定了化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽试验的范围、规范性引 用文件、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、试验成立条件、结果判定 标准。 本方法适用于单一组分或已知组成成分混合物的化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的条款。注明日期的引用文件，其 后所有的修改单 （不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本方法，但是，鼓励使用单位 对修订部分的引用进行研究，并提出意见。研究是否可使用这些文件的最新版本。未注明 日期的引用文件，其最新版本适用于本方法。 经济合作与发展组织 （OECD）guidelines for the testing of chemicals:In Chemico Skin Sensitisation:DirectPeptideReactivity Assay (DPRA).NO.442C （4February 2015）。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本方法。 样品多肽峰面积均值 3.1 多肽消耗值= （1 − ）× 100 溶剂对照多肽峰面积均值 3.2 共洗脱是指检测化合物在220nm处吸收显著，并与多肽有同样的保留时间。 4 试验原理 有致敏性的化学物与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽模拟的皮肤蛋白共同孵育，导致多肽 量减少。测定多肽减少量，从而判定受试物是否具有皮肤致敏性。 5 试验材料与试剂 5.1多肽片段与纯度 半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，纯度范围：90-95%。 赖氨酸多肽：Ac-RFAAKAA-COOH，纯度范围：90-95%。 5.2阳性对照与受试物的配制 试验当天配制阳性对照和样品溶液，浓度均为100mM，阳性对照为纯度90%以上肉桂 醛。 溶剂选择：乙腈、水、丙酮，以及其他不影响肽稳定性的溶剂。 1 5.3 多肽贮备液的配制 5.3.1半胱氨酸多肽贮备液：称取适量半胱氨酸多肽，用pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成 0.667mM的溶液。 pH 7.5 磷酸盐缓冲液：取0.1M磷酸二氢钠溶液18mL与0.1M磷酸氢二钠溶液82mL混合， 测定pH值，应在7.5±0.5之间。若偏酸性，加入0.1M磷酸氢二钠溶液进行调节。若偏碱性， 加入0.1M磷酸二氢钠溶液进行调节。 5.3.2赖氨酸多肽贮备液：称取适量赖氨酸多肽，用pH10.2的醋酸铵缓冲液配制成 0.667mM的溶液。 pH10.2乙酸铵缓冲液：取乙酸铵1.542g，加水200mL溶解，用氨水调节pH值至10.2。 5.3.3 多肽标准溶液的配制 稀释溶剂A：含20%乙腈的pH7.5磷酸盐缓冲液;配制方法：2mL乙腈加8mLpH7.5磷酸 盐缓冲液。 稀释溶剂B：含20%乙腈的pH10.2醋酸铵缓冲液;配制方法：2mL乙腈加8mLpH10.2醋 酸铵缓冲液。 半胱氨酸多肽标准溶液配制方法见表1，赖氨酸多肽标准溶液配制方法见表2。 表 1 半胱氨酸多肽标准溶液配制方法 单 体 单 剂量 体积 TA 溶剂 终浓度 位 积 位 半胱氨酸贮备液 1 1700 µL + 300 µL 乙腈 0.5670 mM (0.667mM) 2 1 mL 1 + 1 mL 稀释溶剂B 0.2835 mM 3 1