竞争多聚酶链式反应(PCR)技术.pdfVIP

维普资讯 r}f一 弓 鼬鹞 蒙生 ， 67 l2月 微生物学杂志 71 - 译 文 · 竞争多聚酶链式反应 (PCR)技术 -，o．s ert es．w ．．arrick 比6 摘耍 竞争逆转录——多聚酶链式反应 (RT--PCR)技 术与RNA标记技术一样，可用于定量 逆转录与其后 的 多 聚酶链 式 反 应 校正增殖效率，但数据的获得必须在反应 (RT--PCR)相结合可使单个RNA分子 的指数期。通常在凝胶上 用 溃 化 乙锭染 增殖，这种方法被称为RT—PcR，RNA 色，见PCR产物时，反应 已达到稳定期， -- PCR，RNA表型或信使增殖 表 型。与 在这种情况下，有必要用更灵敏的方法来 传统的RNA标记技术相 比，RT--PCR测 检~JPCR产物，如利用放射性标记的核苷 定utRNA的灵敏度高l，000一l0，000倍 ， 酸或引物或通过Shouther标 记 后 用探针 如此灵敏度使得此技术能够检测丰度极低 进行杂交。如果控制顺序和靶基因的表达 的mRNA，如少数 细 胞 或 少 量 组 织 的 水平不同，那么，在反应豹对数期测定数 mRNA、混合细胞群体 表 达 的mRNA。 据也是困难的。此外，在同一反应管中， RT—PCR髓 同时测定多 种mRNA，这是 多套引物的存在，常会互 相 干 扰 增殖过 传统方法不能比拟 的，此 外，RT--PCR 程。竞争RT--PCR克 服 了上 述 多 数困 过程仅需几小时就能完成 。 难 。 尽管RT--PCR在许多方面 比RNA标 记法优越，但要获得定量信息还有困难 ， 竞争RT--PCR 这主要是因为PCR增殖具有指数性质，即 在指数增殖期，增殖效率 的微小变化则导 在竞争PCR@，含有与靶eDNA相同 致产物量的巨大变化。此外，在反应后期 引物模板顺序的DNA片段 与靶cDNA竞 由于必需成份 的消耗和抑制物 的产生，产 争 引物的结台和增 殖 PCR产 物 可通过 物量达到稳定状态 。PCR的这些特点削弱 大小、杂交或限制酶切位点的不同而加 以 了靶cDNA起始量的差异。这些 问题 通过 区别 。 PCR反应的内部控制可被解决。 Becker—Andre和Hahlbrock及 Gi— 内部控制的一种形式就是在同--PCR lliand等人首先描述了竞 争PCR技 术。 管中加入第二套引物，此引物是用来增殖 Gilliand等人利用含一小 内含子靶基 因的 普遍存在的组成型mRNA。日小球蛋 白、 基因组片段 (产生的PCR产物稍大于靶基 肌动蛋 白、二氢叶酸还原酶及磷酸甘油醛 因)或利用合成的加一个特异酶切位点的 脱氢酶的基因可用于此 目的，不幸的是， 靶cDNA，在后一种情况下，PCR产物在 这些基因的mRNA水平并不总是恒定的。 电泳之前要用限制酶消化。Becket—Andre 峰钎在一个拄铷顺序的同i1于能够彻底 和HalbroCk则年I)用台成的含一特 异酶切