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流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入/yp/product-list-700.htmlEDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,?用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--/yp/product-list-700.htmlEDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,?直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm?培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。流式侧细胞周期对细胞的种板密度非常讲究，如果密度过高就会出现接触抑制，所以建议刚开始做预试验时可以种个细胞密度梯度。2细胞收集，细胞培养至一定时间后，如果是贴壁培养的细胞，常规胰酶消化， PBS洗2-3次，制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1－5*106?cells/ml。3.细胞固定3.1.加入3ml 预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，吸净上清。3.2.加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的100% 乙醇（-20℃）1.5 ml，使其终浓度为 75% ，-20℃?放置过夜固定，最长可以放置1周左右。注意：固定细胞时，确保PBS悬浮细胞为单个，加入无水乙醇的时候要慢速，保证逐滴。细胞保存在4℃也可以。4.细胞标记4.1.取出固定的样品，800 rpm×5 min，弃上清。4.2.加入3 ml预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，离心收细胞。注意：可重复1-2次，以除去乙醇4.3.加入150 ul RNaseA（250-500 ug/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。注意：做细胞周期时，RNaseA加与否对结果影响不大；如果要同时测凋亡，尽量加入RNaseA。另外，在做这步之前，可用200目滤网过滤4.4.加入150 ul PI工作液，4℃避光染色30分钟。注意：如果用方法二配制的直接PI工作液，其已含有RNaseA，因此4.3步应省略。PI染液的量可根据细胞的多少来加，比如说有的人喜欢加500ul或1ml，其实只要和细胞完全孵育就可以，量多量少对结果不会影响太大。4.5.转至流式检测管，上机检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由630带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集 10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和在碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率。5、细胞周期分析：正常人静止体细胞有46条染色体，为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期的各个时期（G0（暂时离开细胞周期,停止细胞分裂,去执行一定生物学功能的细胞所处的时期）、G1、S、G2、M）中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，在G1期细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体，进入S期后开始合成DNA，此时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间。当DNA复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质，直到进入M期，因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期，一旦有丝分裂分裂成2个细胞，同样G0和G1期的DNA含量也无法区分。PI/yp/product-list-692.html荧光染料与DNA结合，其结合量与DNA含量