fbw7参与的非小细胞肺癌egfrtkis获得性耐药实验研究 word格式.docxVIP

缩略词OD英文全称opticaldensity中文全称吸光度PAGEPBSpolyacrylamidegelelectrophoresisphosphate-bufferedsaline聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液PCD PCRPIprogrammedcelldeathpolymerasechainreactionpropidiumiodide程序性细胞死亡聚合酶链反应碘化丙啶PS PVDFrpmphosphatidylserinepolyvinylidenefluoriderevolutionsperminute磷脂酰丝氨酸聚偏二氟乙烯膜每分钟转速SCLCSDSTBSTsmallcelllungcancersodiumdodecylsulfateTris-bufferedsalinewithTween-20小细胞肺癌十二烷基硫酸钠吐温-20Tris缓冲液TEMEDUb UPPN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineubiquitinubiquitin-proteasomepathwayN, N, N’, N’-四甲基乙二胺泛素泛素-蛋白酶体途径WBWesternblot免疫蛋白印迹FBW7参与的非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药实验研究硕士研究生：姜秀秀导师：张艰副教授第四军医大学西京医院呼吸内科，西安710032 资助基金项目：国家自然科学基金中文摘要目的：FBW7（F-boxandWDrepeatdomain-containing7,FBW7）是F-box蛋白家族成员，为SCF型泛素连接酶复合物中识别底物的蛋白分子，介导细胞内多种蛋白质的泛素化降解。FBW7是一个抑癌蛋白，通过调控细胞增殖、分化、周期和凋亡相关蛋白的降解参与了肿瘤发生和发展的众多生物学过程。我们前期研究发现FBW7在Gefitinib敏感的亲本细胞和相应的耐药细胞中存在差异性表达，细胞耐药后FBW7表达减少。我们将通过以下方案研究FBW7调控Gefitinib敏感性的分子机制，并探讨以FBW7为靶点逆转Gefitinib耐药的研究策略。方法：1、Gefitinib从10nM开始处理PC-9亲本细胞，每2周加倍Gefitinib浓度，连续培养6个月获得耐药细胞PC-9GR，EGFR基因测序和FISH检测PC-9GR是否出现T790M 和Met扩增；2、通过PCR和Westernblot方法比较亲本细胞与耐药细胞FBW7在mRNA 和蛋白质水平的表达情况；3、通过shRNA下调亲本细胞PC-9和HCC827FBW7表达，观察细胞是否出现Gefitinib耐药性；4、明确FBW7调控Gefitinib敏感性的分子机制，探究Bcl-2家族抗凋亡蛋白Mcl-1在该过程中的作用。结果：1、MTT实验证实PC-9GR对Gefitinib耐药，基因测序和FISH未发现T790M与Met基因扩增；2、亲本细胞FBW7在mRNA和蛋白质两个表达水平均高于相应耐药细胞；3、shRNA慢病毒感染亲本细胞，PCR和Westernblot验证FBW7下调效率，MTT、流式细胞术和Westernblot等功能学实验证实亲本细胞在FBW7表达下调后对Gefitinib敏感性降低，细胞出现耐药表型；4、亲本细胞和耐药细胞Bcl-2家族蛋白存在差异性表达，其中Mcl-1的差异最显著。FBW7通过降解抗凋亡蛋白Mcl-1和调控Mcl-1半衰期t1/2影响细胞对Gefitinib敏感性。结论：1、FBW7在PC-9和HCC827亲本细胞表达量高于耐药细胞PC-9GR和HCC827GR5、HCC827GR6，并且PC-9GR不存在已知的耐药机制T790M与Met扩增，提示FBW7表达下调可能是Gefitinib耐药的一个新机制；2、下调亲本细胞FBW7表达，PC-9和HCC827对Gefitinib敏感性降低，GefitinibIC50增加且细胞凋亡比例降低，推测下调FBW7表达可能稳定抗凋亡分子，抗凋亡分子表达在凋亡刺激下不发生减少，最终导致亲本细胞对Gefitinib耐药；3、下调FBW7表达可以稳定抗凋亡蛋白Mcl-1，减少Mcl-1降解，延长Mcl-1的半衰期t1/2，后者可能是导致Gefitinib耐药的关键分子。关键词：非小细胞肺癌，泛素-蛋白酶体途径，凋亡，FBW7，Mcl-1ThefunctionofFBW7inthedevelopmentofacquired resistancetoepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitorsinnon-smallcelllungcancerCandidateformaster:XiuxiuJiangSupervisor:P