核医学精品教学（温州医学院）第四章体外配体结合分析.pptVIP

第四章 体外配体结合分析 概 述 20世纪60年代,Berson和yalow,放射免疫分析(RIA),诺贝尔奖. 20世纪70年代,Engvall和Wecman,酶标记免疫分析(EIA) 80年代时间分辨荧光免役分析(TRFIA) 化学发光免役分析(CLIA) 电化学发光免役分析(ECLIA) 微粒体发光免役分析(MLEIA) 放射免疫分析 一、原理 Ag+Ab AgAb+Ag + *Ag *Ag+*AgAb 二、必备条件 （一）抗体(结合剂）：高亲和力、高特异性、高滴度 （二）标记抗原 125I,放化纯，长半衰期，标记后不改变抗原活性。 （三）标准品 与被测物为同一物质，定量精确，放化纯高 （四）B与F 分离技术 （五）放射性测量仪 实验操作步骤 1. 配制一系列已知浓度的标准抗  原Ag的反应管，并标明浓度；2.分别向反应管中加入固定量的  *Ag、Ab；3.经过一定时间的温育竞争结合 反应； 4.待竞争结合反应平衡后，分 离结合B（Bond）部分和游  离F(Free)部分；5.用放射性探测器测得*Ag-Ab 放射性为B或游离*Ag的放射 性为F； 6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]， 或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag 为“0”，故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原 浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0 随Ag量变化的曲线即为标准曲线。 8.在相同条件下，测得被测样品Ag的B%或样品/B0%的浓度与标准曲线对照，即可查出被测样品Ag的浓度。 三、分离方法 （一）液相分离技术 1.双抗体沉淀法 2.聚乙二醇法(PEG) 3.葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法 4.活性炭吸附法 （二）固相分离技术 四、实验操作步骤 加样、温育、分离、测定 放射性、数据处理 五、实验分析性能（稳定性） （一）精密度 （二）灵敏度 （三）准确度 六、质量控制 免疫放射分析法 一、基本原理 1968年由Miles和Hales建立免役放射分析法（IRMA）原理:125I标记抗体做示踪剂与非标记抗原(待测样品或标准品)形成复合物,除去多余的游离抗体,测量复合物的放射性。 特点： 1 属于非竞争性抗原、抗体结合反应 2 抗原-抗体复合物的量与所加非标记抗 原的量呈正相关 3 在低剂量区不会有不确定因素 4 免疫放射分析法的非特异结合对低剂 量区结合影响大，对分离条件的要求 非常严格 二、基本方法 （一）双抗体夹心法 （二）标记第三抗体法 （三）其他方法 三、RIA与IRMA的比较 RIA IRMA 标记物 抗原 抗体 原理 竞争性结合 非竞争性 结合 抗体量 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 非放射性标记免疫技术 一、酶标记免疫分析技术 酶联免疫吸附分析法（ELISA） 二、化学发光分析法 化学发应释放自由能，激发态， 退击释放光