激光共聚焦扫描显微镜 简介激光共聚焦扫描显微镜.docVIP

激光共聚焦扫描显微镜 简介激光共聚焦扫描显微镜 1999年4月 热带农业科学 第2期 简介激光共聚焦扫描显微镜 何川生 卢秀萍 (云南省烟草科学研究所) 摘要 介绍了激光共聚焦扫描显微镜的工作原理、基本构造、适用领域及其在生物学和农业研究中的应用前景。 激光共聚焦扫描显微镜(laserscanningconfocalmicroscope),简称LSCM,是近年来发展起来的一项高科技新产品,是一种先进的分子生物学分析仪器。它的工作原理是在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外光或激光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,观察细胞的形态变化和生理功能变化,成为形态学、分子细胞生物学、遗传学、生物化学、材料科学、病理学等诸多领域中有力的研究工具。1987年White和Amos在英国 Nature 杂志发表了 ConfocalMicroscopyComesofAge 一文[1],标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。1998年云南省烟草科学研究所率先在全国烟草行业购置了第一台Bio-RadMRC-1024激光扫描共聚焦显微镜后,引起了广大烟草及其它行业的科研工作者的浓厚的兴趣,纷纷希望将这一仪器用于解决有关学科领域碰到的新问题。本文作者在广泛收集中外文献资料的基础上,就LSCM的工作原理、适用领域以及在生 收稿日期:1998-01-12。 物学和农业研究中的应用前景做一概述,以供国内同行参考。1 LSCM的工作原理 LSCM是一种紫外和激光双重扫描相结合的显微镜,它综合了普通显微镜和荧光显微镜的功能,并配有微机数字化图像分析系统和电子摄影,结合特异性荧光染料可在LSCM下进行亚细胞水平结构的功能的研究 [2,3] 。LSCM采用激光做光源,激光束经 照明针孔,由分光镜反射至物镜并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描,然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(photomultipletube)探测收集,并将信号输送到计算机,在显示屏上显示图像。在此过程中,只有焦平面上的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的不能通过小孔,因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是 何川生等 简介激光共聚焦扫描显微镜 共振的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。这样避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低,图像清晰度和分辨率不高的缺点。LSCM主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机图像处理系统四大部件,包括数据采集、处理、转换及相应应用软件、图像输出设备及光学 装置(如图1)。1 1 激光器 我所购置的MRC-1024型LSCM采用的是气冷式氪 氩离子混合激光管,输出功率为15mw激发光波长为488nm、568nm、647nm。激光束经光纤电缆导入扫描 头。 图1 LSCM基本结构图 1 2 扫描头 扫描头包括:(1)探测通道,由光电倍增管和相应的共焦针孔及滤过轮组成;(2)滤光块,本机配有做细胞标记用的T1/T2A滤光块,有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块,测pH及其它离子,可根据标本不同进行选择;(3)扫描透射探测器(非共焦模式),用于透射光观察样品,扫描头有管道与光学显微镜相连。1 3 光学显微镜 可配置正置或倒置显微镜,本机为ZeissAxiophot型正置显微镜主机,并配有ZeissAxiovert135型倒置显微镜。1 4 计算机及界面 (1)本机配置的计算机硬件:内存64MB,硬盘子1GB。软件:用于图像采集和分析的OS/2、Win3 1等和测定钙离子的TimeCourse/Ratiometric等软件。(2)MRC-1024共聚焦界面,硬件:24比特图像获得及显示卡的相应软件Lasersharp等。(3)21 1999年4月 热带农业科学 第2期寸彩色显示屏,分辨率1280 1024。2 LSCM在生物学和农业中的应用2 1 光学显微镜作为细胞生物学的研究工具,可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞,随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的LSCM,则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构,特别是对活细胞离子含量变化的定量检测,完整细胞的三维立体图像重建等方面,是传统的光学和电子显微镜所无法比拟的。 自从MarvinMinsky于1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理,并获得美国专利后,Egger和Petran1967年成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面,1970年牛津和阿姆斯特