肠道病毒71型3c和3d蛋白对病毒毒力的影响-公共卫生专业论文 word格式.docx

CATALoGUEAbstractinChinese．．1Abstractin EngIish．4Abbreviatio^ ．．：．7IIltroduction．．．．．．．．81．Epidemicofhand-foot．and·mouthdisease．82．Enterovims7l93．Vimlence detemlinalltsofEnterovirus71．．104．Vaccinesand dmgs．．13Mate“alsandMethods．．151．Materjals．．152．Methods22Results．．391．AlignmentsofsequenceofSDLYl07andSDLYl．．．392．Constructionandanalysisoft}lerepIiconofEV7l4l3．Constructionandrescue oftherecombinantvimsesSDLYl07(1-3C)andSDLYl07(1-3CD)．424．AnalysisofvimlenceoftherecombinantVimses．．46Discussion．6lConcIusion．．．．66111novationanddeficiency．．67Appendix．．68Refbrence．．69AcknOwledgments77PubIications．．78Tableofreviewofdissertationanddebate79万方数据山东大学硕士学位论文肠道病毒7l型3C和3D蛋白对病毒毒力的影响专业：公共卫生硕士硕士生：李静导师：温红玲副教授合作导师：陶泽新副主任医师中文摘要肠道病毒71型0，2f舢v驴姗7J，EV71)是小RNA病毒科俨缸D，门口vfr此如P)肠道病毒属(Enterovims)成员，是手足口病(han(I-foot．and．mouthdisease，}Ⅱ?MD) 的主要病原体之一。EV71主要感染5岁以下的婴幼儿，典型的临床表现为发热和手、足、口等处黏膜的疱疹；而严重者可进展为神经系统并发症，如神经源性肺水肿和无菌性脑膜炎等，甚至可导致死亡。目前，EV71的致病机制尚不清楚。而我们的前期研究显示不同毒力的病毒株复制能力存在差别，而3C和3D蛋白是影响病毒复制的关键蛋白，所以本研究将利用反向遗传技术对3c和3D蛋白在病毒毒力上发挥的作用进行研究，为EV7l感染的防治提供理论依据。目的：通过对强毒株sDLYl07和弱毒株SDLYl的3c和3cD编码区的置换构建并拯救重组病毒株SDLYl07(1—3C)和SDL，Y107(1-3CD)，探讨EV71的3C和3D蛋白在病毒毒力上的作用。方法：1．利用基因克隆技术构建微复制子体系pMDl9-T-5’UTR-EGFP-3C-37UTR，并在此基础上研究3C蛋白的功能。2．利用反向遗传技术，将强毒株sDLYl07的3C和3CD编码区置换为SDLYl的3C和3CD编码区，构建并拯救重组病毒株SDLYl07(1—3c)和SDLYl07(1．3CD)，用50％终点法和实时荧光定量PcR技术分别对病毒的滴度和RNA模板量进行测定。万方数据山东大学硕士学位论文3．在细胞水平上(RD细胞和Vero细胞)对重组病毒株SDLYl07(1—3C)和sDLYl07(1—3CD)的复制能力和对细胞的损伤作用进行研究。4．在动物水平上(一日龄ICR乳鼠)对重组病毒株SDLYl07(1-3C)和SDLyl07(1-3CD)的毒力进行研究。结果：1．成功构建了微复制子体系pMDl9．T_5’UmEGFP．3C．37UTR，并在细胞中检测到了荧光蛋白的表达，即3C蛋白也成功表达；但微复制子体系在细胞中并不能进行复制，该体系不能用于研究蛋白在病毒复制中的作用。2．成功构建并拯救了重组病毒SDLYl07(1—3C)和SDIⅣ107(1-3CD)，并利用50％终点法和实时荧光定量PCR技术分别对病毒的滴度和RNA模板量进行了测定。3．细胞试验结果：重组病毒sD【Y107(1．3C)的复制能力在37℃和39．5℃条件下均没有发生改变；SDLYl07(1．3c)对细胞的损伤能力也与SDLYl07株没有明显的区别。而重组病毒SDLYl07(1．3CD)的复制能力和对细胞的损伤能力发生改变。sDLYl07(1-3cD)在37℃条件下，复制能力稍有下降，在39．5℃条件下显著下降；同时，37℃条件下，SDLYl07(1．3CD)对细胞的损伤能力下降(但强于sDLYl株)，而在39．5℃条件下对细胞的损伤能力显著下降(与SDLYl株没有明显区别)。以上结果说明3D蛋白存在影响病毒复制和温度敏感性的位点。4．动物试验结果：重组病毒SDLYl07(1．3C)对动物的影响与SDLYl株没有区别。而