Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术[精品].pptVIP

半定量RT-PCR原理 半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后，扩增目标cDNA和内参cDNA，通过PCR产物量推测样品中特异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列，其表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：β-actin（β肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等 * 步骤： 1.抽提RNA，2.反转录获得cDNA，3.以cDNA为模板做PCR 注意： 步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和GAPDH俩中。步骤3，半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！ 半定量RT-PCR步骤 * TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,