基因克隆技术-2008年.ppt

内切酶的选择 只有Apa I和EcoR I可供选择 5’CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATATCGCTTAG3’ 5’TATAGGGCCCTTGGCTTGATCGCTAAA3’ 正向引物 反向引物 EcoR I Apa I 保护碱基 保护碱基 注意三联体密码子不要错位 菌株 218nmOD KT2440 0.38A55 2.29B5 2.3210K+A55 0.4210K+B5 0.47 菌株 218nmOD KT2440 0.38A55 2.29B5 2.326.1K+A55 0.516.1K+B5 0.53 菌株 218nmOD KT2440 0.38A55 2.35 3.2K+ A55 0.452.7K+ B5 2.36 菌株 218nmOD KT2440 0.38 A55 2.36 ORF4+A55 0.71 ORF5+A55 2.39 ORF4的核酸序列及其编码的蛋白质氨基酸 JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 2005, p. 1293–1304 Ectoine-Induced Proteins in Sinorhizobium meliloti Include an Ectoine ABC-Type Transporter Involved in Osmoprotection and Ectoine Catabolism ORF4: probable /Putative peptidase A B C D C: 半醛脱氢 D: 氨基转移 B: 酰胺键断裂 A: 开环 THANK YOU ! * 测序结果表明该阳性克隆子含有5143个碱基对，其中包含有18个潜在的ORF（大于150bp），对这些潜在的ORF分别进行亚克隆和序列比对分析，最后确定编码噻磺隆水解酶的基因的大小为1194kb，命名为tsmE。 这是首次从微生物中克隆能够水解磺酰脲类除草剂，消除其药害的降解基因。目前正在进行该新基因的表达、TseE酶的纯化和特性研究。 tsmE 阳性克隆子插入片段ORF分析 5.2 转座子插入诱变 Pseudomonas putida kt2440：6.18186Mb,编码5350个蛋白， 转座子（TN）：位于染色体或质粒上可自主复制和位移的基本单位。(几千个bp) 1. 要有一个好的抗性标记； 2. 转座子所在载体必须是自杀性的； 3. 插入位点的随机性要好； 4. 转座子不会在染色体上跳跃。 自杀性质粒pSC123图谱 四氢嘧啶降解相关基因的克隆 Pseudomonas putida kt2440：metabolically versatile, Gram-negative, saprophytic soil and water bacteria 供体菌（Kan）培养 受体菌(Cm)培养 离心、洗涤 按一定比例混合 双亲杂交 筛选转座子插入的转化子 筛选不能利用四氢嘧啶为唯一碳源的转化子 筛选不能降解四氢嘧啶为唯一碳源的转化子 转化子验证 Kan,Cm,四氢嘧啶为唯一碳源（筛突变库） Kan,Cm,琥珀酸钠为唯一碳源（建突变库） 紫外检测验证 科学的筛选策略（如果受体菌没有抗性？底物不同 ，尽量缩小范围） 杂交条件 杂交时间的选择 小量多批 —表示不生长，+表示生长，（+++++为出发菌株在不含抗性的基础盐平板上菌落大小） —表示不生长，+表示生长，（+++++为出发菌株在不含抗性的基础盐平板上菌落大小） B5 B7 能降解四氢嘧啶的插入突变株 获得了14个四氢嘧啶降解突变子E1、E2、B5、B7、A28、A30、A31、A38、A40、A43、A54、A55、A56、A58 1. 反向PCR 2. 质粒拯救法 3. 酶联-PCR法 4. Arbitrary Primed PCR法 6. SEFA-PCR法 获得转座子两端序列的方法 5. Tail-PCR法 限制性酶切 酶连 限制性酶切—在转座子内切开 1. 反向PCR 限制性酶切 pUC19 限制性酶切 Kan 转化，Kan+Amp筛选 酶连 2. 质粒拯救 限制性酶切 pUC19 限制性酶切 3. 酶联-PCR法 酶联 酶联后直接PCR 4. Tail-PC