第十章固定化酶.doc

专题4 酶固定化技术 1.概 述 1953年Grubhofer和Schleith首先将羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。从60年代起，固定化酶的研究迅速发展，综述和专著大量涌现。现在，酶的固定化已拥有一套成熟的技术，而且在此基础上，已发展了细胞固定化技术。近年来，细胞器固定化技术、固定化多酶反应器、固定化微生物多酶反应系统、固定化酶—微生物复合物等技术相继发展起来，因而使生物工程更趋向于相互联系，综合发展。酶的固定化技术则是这一发展的基础。 1.1固定化酶的涵义 酶是高效性的专一性强的生物催化剂。但是酶在水溶液中，一般不很稳定；作为催化剂，酶液只能一次性地起作用；若是用于医药或是化学分析，酶必须很纯，如此一次性使用，必然耗资可观。为了克服这种种缺点，人们开始探索将水溶性酶与不溶性载体联结起来。使之成为不溶于水的酶的衍生物，又能保持或大部分保持原酶固有的活性，在催化反应中不易随水流失。这样制备的酶，曾被称为水不溶酶(water-insoluble enzyme)、固相酶(solid phase enzyme)“bound enzyme”“fixed enzyme”等等。后来发现，一些包埋在凝胶内或置于超滤装置中的酶，本身仍是可溶的，只是被限定在有限空间不能自由流动而已。因此，1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”(immobilized enzyme)这一名称。所以，固定化酶，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 1.2固定化酶的优点与缺点 1.2.1优点 固定化酶与水溶性酶相比，具有下列优点： (1)固定化酶可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高，因而单位酶催化的底物量大增，用酶量大减，亦即单位酶的生产力高。 (2)固定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中，没有酶的残留，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。 (3)固定化酶的反应条件易于控制，可以装柱(塔)连续反应，宜于自动化生产，节约劳动力，减少反应器占地面积。 (4)较水溶性酶更适合于多酶反应。 (5)辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生体系或氧化还原体系合并使．用，从而扩大其应用范围。 1.2.2 缺点 固定化酶虽然有上列优点，但用于工业生产的实例，至今仍然不多。原因就在于固定酶的应用尚存若干困难或缺点。 ⑴ 固定化酶所用载体与试剂较贵、成本高、工厂投资大，加上固定化过程中酶活力有损失，即酶活力回收率低，更增加了工业化生产的投资困难。如果用胞内酶进行固定化，还要增加酶的分离成本。固定化酶在长期使用后，因染杂菌，酶的渗漏，载体降解以及其它错误操作，也会致使酶失活。 ⑵ 固定化酶一船只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。 ⑶ 目前固定化酶尚限于单级反应，多酶反应，特别是需要辅因子的固定化酶技术，还有待开发。 1.3研究固定化酶的理论意义 酶促反应机理的研究，是阐明生物体内各种复杂代谢过程及其调控的基础。随着分子生物学的发展，现在已愈益清楚地认识到，生物细胞内大多数主要代谢酶，都是定位在生物膜上或亚细胞结构之中，它们在细胞中的这种结合状态，则是构成代谢过程乃至整个生命物质运动的严密有序性的基础。 以往酶学研究中，人们总是把酶从细胞的结合状态分离出来，加以探讨。酶学在理论上和实践上取得的辉煌成就，表明这种研究方法无疑是必要的，接近真实的。然而现在确也证明，结合在细脑膜和亚微结构中的酶，在催化性质上，毕竞与水溶状态下的酶存在差异。为了阐明生物体内的代谢规律，对于这种结合状态的酶，必须用更逼近真实的体系和方法来深入研讨。而固定化酶，在很大程度上可用作这种研究的理论和实验模型。固定化酶的研究，有助于了解生物体内膜或凝胶类的微环境对酶功能的影响。在一定程度上可以说是一种生物模拟。 利用酶的固定化技术，进行调节酶的亚基固定化和重组酶，使一些在溶液状态难于解离为“天然”亚基的酶得以解离，从而确定这些酶的四级结构和亚基功能。 利用酶的固定化技术，可以改变酶的性质。例如固定化辅因子，使酶不再要求游离辅因子。在效应物存在下(保护酶)进行化学固定化处理，使酶的构象“冻结”，从而使酶不再受效应物的影响。在底物存在下进行固定化处理，使其构象“冻结”，从而使酶处于高底物亲和力构象状态。 固定化酶技术转化为亲和色谱技术，应用于分子生物学研究，为酶等生物化学制剂提供快速的分离纯化手段。 固定化酶的动力学研究，还可以为农业化学和土壤化学中常遇到的类似体系，提供有益的启迪，乃