外源基因的表达2教学幻灯片.ppt

SD序列是原核生物mRNA分子上一段富含嘌呤的序列，由4~9个碱基组成，一般位于起始密码子上游约8~13个核苷酸的位置，是一段高度保守的序列，以…AGGA…为核心。它可以和16SrRNA的3’-端序列互补，可以使mRNA上位于SD序列下游的第一个AUG作为起始密码子，起始翻译。也叫做核蛋白体结合位点(ribosomal binding site, RBS) S-D序列 (Shine-Dalgarno sequence ) IF-3 IF-1 mRNA在小亚基定位结合 A U G 5 3 mRNA mRNA与小亚基的结合依赖于： SD序列与16S rRNA 3’端部分序列的互补 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，一般SD序列至少含AGGAGG序列中4个碱基。对多数基因而言，上述碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低 SD序列与翻译起始密码子之间的距离 SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低 起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。 从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。 密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 常见的表达受体菌株 宿主菌株 表达载体启动子 BL 21 T7 HMS174 T7 M5219 PL RB791 Plac, Ptac 2、附加构件（组建融合蛋白） 蛋白分泌/保护信号 分离纯化信号 蛋白分泌/保护信号 外源蛋白，特别是相对分子质量较小的蛋白，在异源宿主细胞中的含量通常都很低，因为在大多数情况下，外源蛋白都会被宿主细胞降解，解决这一问题有两种办法。 将要表达的外源蛋白与一个宿主的蛋白共价连接，构成融合蛋白； 在外源基因前加入一段信号序列，将外源蛋白分泌到细胞周质外。 将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 分离纯化信号 为了有效、简便地纯化在原核细胞中表达出的外源蛋白，方便下游的纯化工作，人们设计了各种融合蛋白的表达载体，即在外源蛋白的N端或C端加上标记物，利用标记物的某些特性进行亲和纯化。 目前应用较多的标记物有： 谷胱甘肽S-转移酶标记 6×His标记 Flag和HA标记 钙调蛋白结合蛋白标记 论述：影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的表达产量----单位体积产量------细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量；单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。因此必须从以下因素入手，寻找提高外源基因表达效率的有效途径： （1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接 相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和 ATG的间距等。 A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的 下游，可增加基因的表达。lac、trp、 tac、 bla。 B、核糖体结合位