荧光分光光度计CaryEclipse.ppt

荧光分光光度计 基础知识 By VarianCD Zuomingfu 硬件原理 Cary Eclipse光路图 发光类型 Photoluminescence光致发光 Fluorescence 荧光 Phosphorescence 磷光 Chemiluminescence 化学发光 Bioluminescence 生物体之发光 Electroluminescence 电致发光，场致发光 Radioluminescence 辐射发光 Triboluminescence 摩擦致发光 Sonoluminescence 声致发光 Catho doluminescence 阴极发光 荧光、磷光产生 荧光，磷光光谱间的特点 仪器数据采集工作方式：荧光、生化发光 荧光（寿命10-11－ 10-7秒） 需要光源激发 激发光源照射的情况下测量样品产生的发射光 生化发光 不需要光源激发 照射光源熄灭的情况下测量样品本身产生的发射光 仪器数据采集工作方式：磷光 磷光 (寿命 10-3 － 102 秒) 需要光源激发 激发光源熄灭的情况下测量样品的发射光 Scan 扫描光谱 激发光谱 发射光谱/荧光光谱 发射光谱/荧光光谱 同步扫描光谱 光谱校正 激发和发射光谱实际情况 如何校正 Commands 菜单 校正因子存储在 EPROM Concentration 荧光定量分析 荧光测量的优点 灵敏度高 比UV-Vis方法灵敏 100 - 1000 倍 UV-Vis方法测量的是一定波长的光透过样品后的衰减，是高背景上的相对值 荧光是样品被激发后发出的光，测量的是低背景上的绝对发光 选择性好 能吸收光辐射的分子不一定都能发出荧光共轭?键，刚性平面结构，给电子取代基 能发出荧光的分子结构或介质环境不同，荧光光谱也不相同吸收（激发）和发射光谱 混合物的分析测定（同步扫描） 光度分析之不足 Not a universal technique - not many molecules fluoresce　并非一种通用技术，不太多的分子能发荧光 Requires more expertise / understanding　需要更多的专门技术和知识 Relative technique 　相对分析技术 荧光定量基础 ф：荧光效率，一般与波长无关 I0：入射光强度，（I0-I）为样品吸收的光通量 K：样品吸收系数 C：样品浓度 L：吸收光程 荧光灵敏度比UV好，因为：荧光与入射光强度成正比，可以用很强的Xe灯作光源。检测弱光时可以用光电倍增管。 c浓度适宜的情况下，荧光和溶液浓度成正比。 荧光强度的概念 相对值 没有单位 仪器不同，强度也不同 所以，荧光测量需用工作曲线来校正（相对分析）。 线性范围很窄，减小误差的最好办法是稀释到线性范围。 影响荧光强度的因素 影响荧光强度的因素： pH 溶剂 温度 其它因素： 浓度：荧光与溶液浓度只在很稀的情况下才成立。溶液太浓，由于激发光束和发射光束都产生吸收，造成非线性。 氧分子的荧光淬灭。如果溶剂没有除气时。 光解作用。激发光束与样品溶液发射光解（褪色）反应。 样品混合物的光谱重叠，激发、发射的谱带重叠。调节狭缝宽度。 污染：玻璃容器，移液管等。 较小的环境效应：重原子效应，杂质淬灭，粘度。 降低入射光束散射干扰（瑞利散射，拉曼散射）的办法： 调整激发波长 发射光束加滤光片 减出空白 影响荧光定量的因素 样品处理带来的发光，如指纹 溶解的杂质带来的发光 玻璃容器 试剂杂质 细菌生长带来的发光 一般实验室污染造成的发光 高浓度下的“Inner Filter” Effect 测量大浓度样品的情况 定量小结 荧光强度仅在很低浓度的情况下才和溶液浓度成正比 必需确定仪器的线性范围 典型情况 Cmax= 0.05/el ， e 激发波长处的摩尔吸收系数，l为池长。 时间相关谱图测量 时间相关谱图测量 激发和发射波长固定不动，测量荧光强度随时间的变化情况 动力学测量（Kinetics） 化学反应常改变荧光强度 时间刻度可为s?min?hr 磷光寿命测量Lifetimes (phosphorescence) change in intensity usually due to uni-molecular processes 时间刻度为ms?s 动力学应用（Kinetics application） 测量发射强度随时间的变化，包含： 荧光Fluorescence 磷光Phosphorescence 生化发光Chemi/Bio-luminescence 最后得到荧光强度对应时间的谱图，再用零级、一级、二级公式拟合 寿命测量应用（Lifetimes application） 时间刻度 磷光 (ms － sec)