荧光双向差异凝胶电泳DIGE.ppt

七 思考题 1. MS原理、特点及其MS系统。 2. 四极杆质谱、飞行时间质谱仪原理。 3. 生物质谱的基本原理。 4. 生物质谱的电离方式。 5. 生物质谱的常见类型。 6. 何为串联质谱？CID的离子类型。 7. MS法分析蛋白质及多肽的步骤。 8. MS前样品的制备。 9. 何为PMF？如何应用。 10. 如何应用串联质谱法鉴定蛋白质？ 第八章 蛋白质组研究中的定量方法 概述 化学标记定量法 蛋白质芯片 蛋白质定量分析策略 不同染色方法的比较 Cy3和Cy5染料的化学结构式 Comparison of 2D-DIGE imaging and Sypro Ruby post-staining ICAT标记方法的步骤: 1. 将来自一种状态下的细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D0试剂标记蛋白质侧链上的Cys残基；将来自另一状态下的同种细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D8试剂标记； 2. 将两种样品混合在一起，用trypsin酶切，产生多肽片段，包括标记的和未标记的； 3. 样品经SCX-RPLC两维色谱分离，除去消化酶、去垢剂、还原剂和ICAT试剂； 4. 混合物经过抗生物素和色谱柱分离，得到只含有同位素标记的多肽混合物； 5. 将分离得到的标记多肽混合物再用RP-μlC-MS分离和鉴定。 ICAT策略的优点: 1. 若一种蛋白质酶切产生至少一个Cys残基的肽段的话，就可以对其进行鉴别和定量。含有Cys残基的肽段越多，结果对照得出的结论就越准确； 2. 鉴定的肽段中肯定都会有至少一个Cys，因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件； 3. 肽段根据标记情况有选择性地得到了富集，从而减少了下游质谱分析的复杂程度； 4. 分离出来的标记多肽可直接与后面的RP-μLC-MS分析系统在线偶联操作； 5. 可直接对混合样品进行分析； 6. 可对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定，尤其是对膜蛋白等疏水性蛋白质； 7. 可快速找出功能性蛋白质； 8. 无需繁冗的双向凝胶电泳分析分离； 9. ICAT软件及质谱技术平台系统可用于全自动快速鉴定蛋白质。 ICAT策略的缺陷： 1. 不能获得不含Cys的肽段，同时翻译后修饰的检出率较低，而酵母细胞中约有10%左右的蛋白质肽链上没有Cys残基，因而得不到鉴定； 2. ICAT试剂的分子质量为500Da左右，相对肽段而言较大，增加了数据库检索算法的复杂性，对于较小片段的修饰可能会影响数据库搜索； 3. 耗时太长，数据存储消耗在表达量没有改变的蛋白质上，而这些蛋白质可能与研究的问题没有太大的关联； 4. 相对于双向凝胶电泳技术，该方法有高分子量偏性。 ICAT策略的改进措施： 1. 采用了固相氨基酸同位素标记试剂来代替ICAT试剂； 2. 采用多维LC-MS/MS分析系统，把鉴定和定量分开； 3. 双向凝胶电泳技术与ICAT技术互补结合测定蛋白质在两样品中的相对含量 4. 磷酸化蛋白质同位素标记亲和标签(Phosphoprotein isotope-coded Affinity Tags, PhIAT) 技术。 * * 蛋白质定量差 异分析技术 基于胶的差异分析技术 非胶差异分析技术 双向凝胶电泳 (2D) 荧光双向差异凝胶电泳 (DIGE) 多维液相色谱-MS分离鉴定系统 稳定同位素特征标签生物质谱(SIAMS) MCAT (mass-coded abundance tagging) 蛋白质芯片 基于整体蛋白质的质谱差异分析 ICAT iTRAQ ++++ ++ ++ 2-2000 ng 250 荧光标记 ++++ ++++ +++ 2-2000 ng 400 荧光染色 + + + 100-150 ng 200 银染 + + ++ μg 105 考马斯亮蓝染色 对软硬件要求 试剂耗费 与质谱兼容性 线性范围 灵敏度(pg) 染色方法