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度和条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进行杂交信号的检测。 (四) 核酸探针技术在动物检疫中的应用　核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒 (菌)株和寄生虫。目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术，这方面的研究报道数以万计且与日俱增。但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费用较高，在动物检疫中尚未推广。多在实验室内对病原作深入研究时使用。 三、 聚合酶链反应　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测。1. PCR的基本原理和过程　PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的 条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。这样，目的的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环， DNA量达原来的上百万倍。 PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+ 存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。 PCR扩增示意图 4.PCR衍生技术　PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。(1) 反转录PCR(reverse transcription PCR，RT－PCR)　RT－PCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA做为PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常 PCR方式扩增 cDNA。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。(2) 锚定PCR(Anchored PCR)　通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。 (3) 反向PCR(Inverse PCR)　常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。 (4) 不对称PCR(Asymmetric PCR)　不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50:1-100:1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分离单链即可直接进行序列分析等研究。 5.PCR技术的用途(1) 传染病的早期诊断和不完整病原检疫　在早期诊断和不完整病原检疫方面，应用常规技术难于得到确切结果，甚至漏检，而用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA或RNA或样品中病原体破坏后残留核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。(2) 快速、准确、安全检测病原体　用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体，一个 PC