分子生物学第05章节核酸的分子操作.pptVIP

测序酶 化学修饰T7 DNA聚合酶是将天然T7 DNA聚合酶与O2、低浓度的Fe 2+ 一起保温数天，修饰T7 DNA聚合酶的N端结构域，使其丧失99%以上的3＇→5＇外切酶活性，而聚合酶活性不受影响，称为测序酶（sequenase）。后来又发展出了基因工程手段产生出一种改进的测序酶（测序酶2.0版），它完全丧失了3＇→5＇外切酶活性。 DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性 切口平移标记核酸探针 带有易检测标记的、已知其序列或来源的DNA片段称为探针。探针的用途是通过碱基互补探寻能够与之杂交的未知DNA片段。 先用DNaseⅠ（牛胰）轻微作用于DNA（在Mg 2+存在下），在双链DNA上产生一些切口，然后用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及4种dNTP（其中1种带有32P标记）进行切口平移标记。此法利用的是该酶的聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。 图5－4 切口平移法制备32P标记的探针 Klenow片段的产生 用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端70%的分子量为76 kD的片段，称为Klenow片段。Klenow fragment 具有聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，没有5＇→3＇外切酶活性。5＇→3＇外切酶活性位于全酶N端分子量为36 kD的小片段中。现已用基因工程的方法直接生产Klenow片段（Klenow酶）。 随机引物标记法制备探针 先使待标记的双链DNA变性成单链，再与6bp长的随机引物混合物一起退火，加Klenow酶和4种dNTP（其中1种带有32P标记）合成模板的互补链。互补链从引物的3＇端延伸。 图5－5 采用Klenow酶的随机引物标记法 逆转录酶 已经商品化的逆转录酶有两种：一种是来自禽成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV），称为禽源逆转录酶。它包括两条多肽链，α链65kD，β链95kD，具有逆转录活性及很强的RNaseH活性（降解DNA:RNA杂交双链中的RNA）。另一种是从一株能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒（mouse leucocytosis virus, Mo-MLV）逆转录酶基因的大肠杆菌中分离得到的，称为鼠源逆转录酶。它是分子量为84kD的单链蛋白，具有逆转录活性和相对较弱的RNaseH活性。 逆转录酶 由于RNaseH活性对RNA模板有破坏作用，因此禽源逆转录酶制剂中高水平的RNaseH活性往往趋向于抑制cDNA的产量，并限制cDNA合成的长度。然而，与鼠源逆转录酶相比，禽源逆转录酶能更有效地拷贝较复杂的mRNA。 T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶与Klenow酶相似，它们都具有5＇→3＇聚合酶活性及3＇→5＇外切酶活性，而且3＇→5＇外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强。T4 DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶强200倍。 T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶用于补平或标记限制酶消化DNA后产生的3＇凹端，还用于对带有3＇突出端的DNA分子进行末端标记。（先切3＇突出端成凹端，再补上。这一从凹端或平端上循环往复地去除和加上3＇端核苷酸的反应又称为置换反应。） 末端脱氧核苷酸转移酶催化的反应 （同聚物加尾） 末端脱氧核苷酸转移酶是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量（34kD）的碱性蛋白质，由一个26kD的大亚基和一个8kD的小亚基组成。底物是dNTP和具有3＇羟基的单链DNA或具有3＇羟基突出末端的双链DNA。此酶简称末端转移酶。它将dNTP加到3＇末端羟基上，可用来加多聚核苷酸尾。 碱性磷酸酶 催化单链或双链DNA、RNA 5＇端的磷酸基团水解，成为5＇－OH。它也能催化NTP和dNTP 5＇磷酸的水解。 两种碱性磷酸酶 有两种碱性磷酸酶，即来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP在SDS中加热至68℃可完全失活，而BAP对去垢剂和高温的耐受性更强，不便于反应后除去酶活性。用CIP催化的反应一般在pH9.3进行。 碱性磷酸酶的用途 碱性磷酸酶用于： ① DNA或RNA 5＇端标记32P时，除去原有的5＇磷酸； ② 除去载体DNA的5＇磷酸以防自身连接，而不影响带有5＇磷酸的外源DNA片段与载体的连接。 T4 多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶催化的前向反应（正向反应）是将ATP的γ磷酸转移到DNA或RNA的5＇－OH上，用于标记5＇端（用γ－32PATP）。铵离子和磷酸是此反应的抑制剂，所以应该用Tris缓冲液（pH7.4~8.0）。 该酶还可以在高浓度ATP和ADP存在下催化交换反应，使ATP的γ－磷酸与DNA、RNA 5＇端的磷酸