医学实验张园郑雪飞.PDFVIP

05 级医学实验 张 园 郑雪飞 解依荻 宋一萌（主笔） 摘要： 全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM) 是近年来 新兴的一种光学成像技术,它是利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米 厚的薄层内的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉荧光， 继而用计算机进行显像，可以看到样品表面单分子的活动情况，从而可实现对生物样品观测。 它是当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一，可以用来实现对单 个荧光分子的直接探测。本综述简要介绍了全内反射荧光显微技术的基本原理，构造及其在 生物学方面的一些应用和发展展望。 关键词： 全内反射；光瞳远场衍射；消逝波；分辨极限；全内反射荧光显微镜；数值孔径； 生物单 分子； 动态观测 引言： 从古到今,人类在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改进自己观察和了解世 界的工具，其中显微镜的制造应改说为人类观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是 人类观察认识世界上的一次革命。此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认 识达到了一个空前的高度。 但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限,瑞利将之归纳 为 R ≥0. 61 λ/nsin θ ,其中λ为成像光波波长, nsin θ为物透镜的数值孔径,即NA 值，因此 光学显微镜空间分辨极限～250 nm 。 近年来人们开发出了一系列光学显微镜。其中，全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术。 在 1965 年，Hirsch field 完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光 法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新 的突破。虽然它的具体应用还不到 10 年,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力. 上个世纪 80 年代早期，Axelrod 等生物物理学家对 TRIFM 技术及基本原理进行描述， 1 并探索了其生物应用。而直到 20 世纪 90 年代，随着新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器 的出现，TRIFM 技术才得到充分发展。 1995年,Yanagida 小组用TIRFM 技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分 子的成像. 1996 年,Moerner 小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的 三维成像。至今该项技术已经应用到许多单分子的研究中，如肌球蛋白酶活性测量，肌收缩 力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究。 全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米 厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的 活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功 的实现 100nm 甚至更低的空间分辨率。 正文： 一、全内反射荧光显微术的基本原理 1、全内反射概述 全内反射现象是生活中的一种常见现象，如钻石的色彩斑斓和光纤的光线传播等。 图 全内反射 当一束平面光波从折射率为 n 的介质进入到折射率为 n 的介质中,入射光在两介质接 1 2 触面一部分发生反射，一部分发生折射。入射角 θ