付强-金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测的方法的建立(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.5.ppt

金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立 答 辩 人 付 强 专 业 生物化学与分子生物学 指导老师 崔亚丽 教授 答辩日期 2007-5-31 西北大学硕士研究生论文答辩 1 答辩内容 • 背景介绍 • 研究报告 金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 • 全文总结 • 致谢 西北大学硕士研究生论文答辩 2 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 乙型肝炎病毒概述 • 乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原体。 电镜下HBV 颗粒的三种形态 （摘自N Engl J Med 2004, 350: 1118-29） HBV结构模拟图 3 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 4 HBsAg 种类 大蛋白（L HBs） 中蛋白（M HBs） 主蛋白（S HBs） 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 5 HBsAg的主要作用 介导病毒进入宿主细胞 诱导机体产生保护性抗体 （HBsAb） 早期诊断的血清学标志 乙肝病毒表面抗原的常用免疫学检测方法比较 西北大学硕士研究生论文答辩 方法 优点 缺点 双抗体夹心ELISA法 操作简便、快速，特异性高 灵敏度不够高，容易出现漏检 胶体金免疫层析测定法 简便、快速，操作简单等优点，适用于急诊检验的需要 灵敏度不如ELISA法，须与ELISA法并用 免疫荧光法 特异性强、敏感性高、速度快 非特异性染色问题尚未完全解决，技术程序也比较复杂 放射免疫分析法 灵敏度高达ng甚至pg水平，特异性强，精度高，可进行超微量分析 存在放射性污染，不易保存，稳定性差 背景介绍 6 西北大学硕士研究生论文答辩 以磁性微粒为载体的磁分离酶联免疫技术（MAIA） 背景介绍 • 磁性微粒的定义：磁性微粒(magnetic particles)，又称磁性微球(magnetic beads或magnetic microspheres)， 是由超顺磁性纳米粒子与高分子或其它无机材料复合形成的胶态颗粒。 7 GoldMagTM-AS 微米金磁微粒 磁分离酶联免疫法(magnetic affinity immunoassay, MAIA)是20世纪80年代中期由瑞士Serono诊断中心发明的一种免疫检测新技术 。 MAIA技术具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好、无放射性污染等优点，在医学检测、食品安全检测等领域有着很好的应用前景。 西北大学硕士研究生论文答辩 研究目的及意义 • 研究目的 以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进行验证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg 的检测。 背景介绍 • 研究意义 HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。 10 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 Ⅰ. 以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原 HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择 温育时间的选择 显色时间的选择 精密度考察 灵敏度考察 特异性考察 11 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被 包被前抗体溶液在280 nm处具有明显的光吸收，包被反应完毕后剩余溶液在280 nm处几乎没有光吸收出现，说明抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体几乎全部包被在金磁微粒表面。 HBsAb包被前后的紫外吸收曲线 12 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定 不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果 注：P：阳性血清；N：阴性血清 酶标 抗体稀释度 50 100 200 300 400 1:600 P N 1.331 0.056 2.321 0.058 2.573 0.069 2.582 0.051 2.769 0.053 1:800 P N 1.14 0.05 2.168 0.058 2.308 0.054 2.533 0.052 2.362 0.053 1:1000 P N 0.848 0.05 1.839 0.05 2.074 0.05 2.175 0.05 2.208 0.05 1:2000 P N 0.561 0.05 1.113 0.05 1.330 0.05 1.472