发酵工艺试验-韩山师范学院.DOC

李 云 韩山师范学院 生物系 2007.10  实验一 细菌总数的测定 1 实验二 酿酒酵母细胞固定化酒精发酵 5 实验三 管碟法测定抗生素的效价 9 实验四 酸奶的制作和其中发酵微生物的分离 12 实验五 产淀粉酶菌株的分离和筛选 15 实验六 微生物液体发酵曲线的测定 18 实验七 发酵菌种的保藏 21 实验八 小型发酵罐的使用 27 实验一 细菌总数的测定 【目的】 1. 学习采样方法和细菌总数测定的方法 2. 了解平板菌落计数的原则 【原理】 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、 pH 、需氧性等），所得 1 mL （或 1g ）检样中所含菌落的总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志。 本实验应用平板菌落计数法来测定水中细菌的总数。但由于水中细菌种类繁多，而且不同种类细菌对营养成分和生长条件要求又各不相同，甚至差别很大，所以不可能找到一种培养基在统一条件下，使水中所有的细菌都生长繁殖。因此，以一定的培养基平板在一定条件下生长出来的菌落数来计算水中细菌总数仅仅是一个近似值。目前国家最新标准使用的培养基为营养琼脂培养基。 【材料和器皿】 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 试剂：无菌水。 器皿：无菌三角瓶，无菌带玻璃塞瓶，无菌培养皿，无菌移液管，无菌试管等。 【方法和步骤】 水样的采取 自来水 先将自来水水龙头用火焰烧灼 3 min 灭菌，再放开使水流 5 min 后，用灭菌三角瓶接取水祥以待分析。 池水、河水或湖水 应取距水面 10-15 cm 的深层水样，先将已灭菌具塞玻璃瓶瓶口同下浸没在水中，然后将瓶翻转过来，拔掉玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放人冰箱中保存。 其他食品的采样 无菌操作，将检样 25g （或 mL ）剪碎放于含有 225 mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成 1 : 10 均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器以 8 000 -10 000 r/ min 的速度处理 1 min ，做成 l : 10 均匀稀释液。 细菌总数的测定 自来水 用已灭菌的吸管吸取水样 1 mL ，注入空的灭菌培养皿中。共做两个平皿。 分别倒人约 15 mL 已溶化并已冷却到 45 ℃ 左右的营养琼脂培养基，并立即在桌面上作旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一灭菌培养皿，倒人营养琼脂培养基约 15 mL ，作空白对照。 待培养基凝固后，倒置于 36±1 ℃ 温箱中，培养 48±2h ，然后取出进行菌落计数。 池水、河水或湖水等 稀释水样取 3 个灭菌空试管，分别加人 9 mL 灭菌水。取 1 mL 水样注人第一管灭菌水内，摇匀，再从第一管取 1 mL 注人下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为 10-1, 10-2 , 10-3，注意每递增稀释一次，即换用 1 支 1 mL 的吸管。稀释倍数依水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在 30-300 之间的稀释度最为合适，若 3 个稀释度的菌落数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。 从最后 3 个稀释度的试管中各取 1 mL 稀释水加人空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 各倾倒15 mL 已溶化并冷却到 46 ℃ 左右的营养琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 待培养基凝固后倒置于 36 ± 1 ℃ 温箱中培养 48 ± 2h ，然后取出计数。 同时将营养琼脂培养基倒入加有 1 mL 稀释液的灭菌培养皿内作空白对照。 菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 菌落计数的报告 平板菌落数的选择 选取菌落数在 30 ～ 300 之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一年中菌落分布又很均匀，即可． 平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线、一条链，可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计） 稀释度的选择 应选择平均菌落数在 30-300 之间的稀释度，然后乘以稀释倍数作报告（见下表例 1 ）。有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30-300 之间，若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30-300 之间，则看这两个稀释度所长菌落数之比如何来决定，若其比值小于或等于 2 ，则应以两者平均数作报告，若大于 2