生化药物分析及生物检定技术.ppt

生物检定技术 第一节 微生物限度检查 一、定义 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。 二、检查方法 药品微生物限度检查采用活菌计数， 计数方法包括： 平皿法、薄膜过滤法。 一、平皿法 1．设备、仪器及用具 无菌室、超净工作台、恒温培养箱(室)、匀浆仪、恒温水浴箱、电热干燥箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、菌落计数器 (JLQ-ST或JLQ-S2型)、显微镜 (1500×)、天平 (感量0.1g)、锥形瓶、研钵 (直径10～12mm)、培养皿 (直径90mm)、量筒、试管及塞子、吸量管 (1mL、10mL)、载玻片、盖玻片、玻璃或搪瓷消毒缸 (带盖)、大橡皮乳头、小橡皮乳头、无菌衣、无菌裤、无菌帽、无菌口罩 (也可用一次性物品替代)、接种环、酒精灯 (乙醇灯)、乙醇棉球、灭菌剪刀及镊子、灭菌称样纸及不锈钢药勺、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆等。 玻璃器皿均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽灭菌12l℃ 20min，烘干备用。 一、平皿法 2．试剂 稀释剂(pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液)、聚山梨酯80、无菌斯盘80、单硬脂酸甘油酯、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD)。 一、平皿法 3．试验前的准备 无菌室使用前开启紫外灯和空气过滤装置，至少30min；将所需已灭菌或消毒的用品按无菌操作技术要求移至无菌操作室；操作人员按要求穿戴无菌服，进入无菌操作室；操作前，先用乙醇棉球消毒手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用无菌的手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封。启封后先仔细检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉长螨的迹象，对肉眼可见疑似者用放大镜和显微镜观察，若证实为生霉、长螨，即可判定为不合格，无需继续检验。 检验量：一般供试品的检验量为10g或10mL，化学膜剂为100cm2，检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂不得少于4片。一般随机抽取不少于检验用量的3倍量供试品。 一、平皿法 4．药品的预处理 供试液制备若需水浴加温时，温度不超过45℃，从制备到加入检验用培养基不得超过 1h。 (1) 液体供试液 一般取供试品10mL，加入稀释剂90mL中，充分振摇，即可作为l∶10供试液；含王浆或蜂蜜的合剂、滴眼剂可以原液作为供试液；油剂可加入适量聚山梨酯80，再照上法制备成供试液；气雾剂可以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当于10g或10mL供试品，再稀释至100mL，作为供试液。 一、平皿法 4．药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 ① 一般取供试品 取10g，置pH7.0无菌氧化钠一蛋白胨缓冲溶液100mL中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后制备成1∶10供试液。 ② 非水溶性供试品 取供试品5g (5mL)，加入含溶化的无菌斯盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液 (1∶20)。也可以取供试品10g，加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，充分振摇，使其溶解，然后加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL，振摇5～10min，萃取，静置，取水层作为1∶10供试液。 。 一、平皿法 4．药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 ③ 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL(必要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液。 ④ 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内，于45℃水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液。 一、平皿法 4．药品的预处理 (3) 含抑菌成分供试品 当供试品对控制菌的检查有干扰时，需根据供试品的不同情况，适当地进行处理，以消除抑菌成分的干扰。常用的处理方法有以下几种。 ① 培养基稀释法 将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。 ② 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心(3 000 r/min)30min，弃去上清液，留底部集菌液约2mL，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(500r/m