离心机-硕士研究生.pptVIP

细胞分离分析仪器---离心机(centrifuge) 组织形态学实验方法 光学显微镜技术 电子显微镜技术 病理尸体解剖 病理与组织学标本制作 病理组织学制片技术 组织病理学常规染色技术 组织病理学特殊染色技术 免疫组织化学与酶组织化学技术 组织器官生化代谢分析方法 通过离心、电泳和层析方法来分离提取糖、蛋白、核酸等分子及其代谢产物。 通过分光光度法来测量物质含量。 利用免疫学测定物质含量。 利用配体－受体亲和力强的原理，来进行药理学方面的研究。 采用酶学方法来分析物质。 采用同位素标记、荧光标记等方法，来检测物质含量。 采用质谱技术检测小分子物质含量变化。 四大经典的生化技术 分光光度法 离心法 层析法 电泳 离心技术 离心技术应用很广，在生命科学和工业生产的各个领域都有相应的使用。 生物学领域：分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物。 医学领域：主要用于分离、纯化细胞、病毒、蛋白质、酶和核酸。 相关的几个概念 向心力：做圆周运动的物体所受的外力的合力。它的大小取决于外力的大小，方向是与速度的方向垂直，指向圆心。 离心现象：物体远离圆心运动的现象称为离心现象，也叫离心运动。 离心力（centrifugal force，Fc）：它的出现是因为物体所受的外力小于做圆周运动的向心力。 离心力F可以表示为： F=mω2r ω:旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm) m:颗粒质量 RCF(Relative centrifugal force）相对离心力：就是离心力场和重力场g的比值，即离心力场相当于多少个g。 沉降系数(S):是指单位离心立场下的样品的沉降速度。它与样品的质量和密度成正比。书98页表3-6-2介绍了某些生物样品的沉降系数及离心条件。 rpm或者r/min:离心机转速的表示方法，一般对于低速离心机通常用这个参数。 离心机(centrifuge) 实现离心技术的仪器。是生命科学研究的基本设备。 二、离心机的工作原理 （一）重力场中颗粒的分离 颗粒静置一段时间后，受重力场影响会开始沉降运动。粒子越重，下沉越快。反之密度比液体小的粒子就会上浮。 沉降速度(sedimentation velocity)：微粒在重力场中下降的速度。它的影响因素：微粒的大小、形态、密度、重力场的强度和液体的粘度。 如红血球大小的微粒，就可以在重力环境下观察到它的沉降。 如果重力场的强度（g) ，则沉降速度 ， 那么就可以实现生物大分子的分离。 扩散现象： 重力场中扩散现象是无条件的，绝对的。特别是对于病毒和蛋白质类小分子物质，扩散对物质的沉降影响更大。如何克服？？ 离心机即可以通过转子的高速运动产生的强大的离心力，从而加快微粒在离心力场中的沉降速度，达到分离的目的。 （二）离心力场中颗粒的分离： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。 通常，Fc常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。 “RCF”和转速可以通过下列的公式进行换算： RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r 例如：离心机转头平均半径是6cm，当转速是用60000?r/min表示时，离心力240000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。? 也可由下图得出： 计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。 在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFavg），即离心管中点的离心力。 原理：利用样品中各种组分的沉降系数不同(S)而进行分批分离。通常两个组分的沉降系数差在10倍以上。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，仅仅适合粗提或者样品浓缩。 其特点： 介质的密度均一 速度由低向高，逐级离心 分辨率不高，往往适合样品的粗提 对分离的细胞而言，沉降顺序依次：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心(isodensity centrifugation) 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞