成品抗体检测程序-ABclonal.PDF

成品抗体检测程序 操作程序 1 样品制备 1.1 细胞样品制备：对于贴壁细胞，到掉培养液，PBS 洗 2 次；对于悬浮细胞，先 1000 转/min 离心 5 分钟收集细胞，用 PBS 轻轻吹打重悬，再次离心。按照十的七次方数量细胞加入 1ml 裂解液，使用前 5 分钟加入 100x 的 pmsf 和 50x 的 cocktail。冰上裂解 15min ，最后收集裂 解液，4 度 13000 转/min 离心 5min ，取上清至预冷的离心管内，若有测浓度需要，则可取 10ul 出来，剩余的裂解液，加入 3xsds 上样缓冲液，95 度加热 5min。待上样或负 20 度分 装保存。 1.2 组织样品制备：新鲜的组织样品，剪碎，置于已经放在碎冰中预冷的玻璃匀浆器，按照 1:10~1:20 加裂解液（例如 100mg 肝脏组织加入 1ml 裂解液），裂解液在使用前 5min 加入 100x 的 pmsf 和 50x 的 cocktail。多次匀浆，直至组织完全匀浆，收集匀浆液，置于预冷的 离心管中，裂解 10~15min ，4 度 13000 转/min 离心 5min ，取上清至预冷的离心管内，若 有测浓度需要，则可取 10ul 出来，剩余的裂解液，加入3xsds 上样缓冲液，95 度加热 5min。 待上样或负 20 度分装保存。 2 制胶 2.1 根据目的蛋白分子量的大小选择合适的分离胶浓度 分子量(kDa) 分离胶浓度 ≤20 15% 20~50 12% 25~72 10% 72~200 8% 1 2.2 小型的垂直电泳槽，对于 1mm 的玻璃板，分离胶灌4.5ml ，加入异丙醇封胶，约30min 后，分离胶凝固，到掉异丙醇，灌入浓缩胶 1ml ，插上梳子。凝固1~2h 后使用。 分离胶浓度 试剂 8% 10% 12% 15% 18% 20% 水（ml ） 4.6 4.0 3.3 2.3 1.3 0.6 30％丙烯酰胺（ml ） 2.7 3.3 4.0 5.0 6.0 6.7 1.5MTris －Hcl （PH8.8 ） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10％SDS （ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 10％AP （ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 TEMED （ul ） 5ul （视实验室温度而定） 总体积 （ml ） 10 10 10 10 10 10 浓缩胶浓度 试剂 5% 水（ml ） 2 2.7 4 6 30％丙烯酰胺（ml ） 0.5 0.7 1 1.5 1.0MTris －Hcl（PH6.8 ） 0.5 0.7 1 1.5 10％SDS （ml ）