基因工程与敲除鼠演示教学.pptVIP

基因工程与基因敲除(genetic recombination and genetic engineering);基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。;基因工程目的： ① 分离获得某一目的基因或DNA ② 获得目的基因的表达产物（蛋白质）;重组DNA技术的基本流程; 本节主要内容 一、重要的工具酶 二、基因克隆常用的载体 三、重组DNA基本原理 四、重组技术在医学和制药工业中的应用 五、基因工程制备敲除鼠文献解析;一、重要的工具酶;工具酶;（一）限制性核酸内切酶(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性，一般分为三类： ——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型， 其中常用的是Ⅱ型限制酶。 ;⑴ 产生5-粘性末端; ⑶ 产生平头末端/钝端;同裂酶 ;同裂酶——同识同切;同裂酶——同识异切;同 尾 酶;可变酶;（二） DNA聚合酶（DNA polymerase ); 1. DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ）  ;E. coli DNA pol. Ⅰ催化切口平移;DNA pol Ⅰ应用;2. Klenow片段（DNA pol.大片断）;Klenow片段用途;3. Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）;（三）逆转录酶; 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。;（四） DNA连接酶(DNA ligase) ;（五） 碱性磷酸酶 ;（六）末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT) ;重要的工具酶;二、基因克隆常用的载体;（一）载体必须具备的基本条件;（二） 载体的种类;（三） 常用的载体 ; pBR322质粒;;; λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细??。 溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。;; 三、重组DNA基本原理;(一) 目的基因的获取（分）;1. 基因组DNA(基因文库);2. 制备cDNA;3. 聚合酶链反应( PCR);4. 化学合成法; (二) 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1. 粘性末端连接 2. 平头末端连接 3. 人工接头法 4. 同源多聚尾连接法; 1. 粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。; 2. 平头末端连接 在T4DNA连接酶的作用下将平头末端的目的基因与载体DNA连接起来。 ;3. 人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘性末端→连接，构建重组DNA。;4同源多聚尾连接法; 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 ; （四） 重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体 4） 原位杂交技术;平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。 (1) 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基