实验中医学形态学方法及其在中医研究中的应用光镜技术.ppt

* 免疫组织化学染色方法 标记物有荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等。 按标记物的不同，可分为： ① 免疫荧光法（荧光显微镜观察） ② 免疫酶标法（光镜或电镜观察） ③ 免疫金银法等（多用于电镜观察） * 免疫组织化学原理模式图 抗原 抗体 荧光素 辣根过氧化物酶 胶体金 * 上图 免疫组织化学（荧光素标记） 毛细血管内皮细胞呈第Ⅷ因子关连抗原阳性。 下图 免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记） 胰岛B细胞呈胰岛素阳性 * 抗原指能够刺激机体产生特异性免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应的物质。 抗体指机体在抗原刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。 单克隆抗体：选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 荧光细胞化学：细胞化学所采用的抗原或抗体采用荧光素标记，经激发光的照射发出明亮的荧光，以便观察目标细胞有关抗原或抗体的性质、定位和定量。 * 5．放射自显影 什么叫放射自显影，其大致的原理是什么？有什么优点？ 放射自显影是将放射性同位素或同位素标记的物质注入体内或组织培养的营养液内，间隔一定时间后取出被检材料，制成标本切片或整体切片，并在其上涂上感光材料，置于暗处曝光，待数日或数周后，再经显影和定影处理，在放射性同位素或标记物所存在的部位，感光材料中的溴化银被还原成微细的银颗粒。这样可在光镜或电镜下观察结构的同时，观察放射性同位素或其标记物的分布、数量、排泄等代谢过程，以此可判明该物质的动态变化过程及其与功能的关系。 * 放射自显影的优点是标记的灵敏性提高，因此是研究追踪某些物质在体内或细胞内的代谢径路与结构的关系。 在生物医学研究中，常用放射同位素主要是能量低、射程短、电离作用强的β射线，有3H、14C、32P、35S、125I等及其化合物。如将125I注入体内，观察碘在甲状腺内的代谢情况。 放射自显影　甲状腺125I * 6．流式细胞术 什么叫流式细胞术？具有什么用途？ 流式细胞术（FCM）建立在计算机、激光科学、流体力学、单克隆抗体制剂，定量细胞化学和定量荧光细胞化学等知识及技术的应用上。该技术可以对单一的细胞逐个地进行高速的定量分析和分类，测量细胞的多种参数，如细胞大小、形状、胞浆颗粒、类型，细胞的面积、周长、核质比，或用荧光染色后测量细胞DNA、RNA含量，细胞总蛋白量等和免疫标记的其他参数。 FCM每秒可测数千到数万个细胞，并且准确，有高度的重复性。 * 流式细胞仪可计量的主要参数概括为结构和功能两个方面。结构包括：① 细胞的大小、形态；② 细胞核与细胞浆的比值；③ 色素颗粒及含量，如血红素、叶绿素、脂褐素等；④ 亚细胞结构的形态；⑤ DNA、RNA的含量，碱基比例及蛋白质含量；⑥ 细胞表面抗原；⑦ 碱性蛋白；⑧ 染色体结构；⑨ 细胞表面糖原等。功能方面包括：① 氧化还原酶的状态；② 生物膜的完整性、流动性、通透性或微黏度；③ 表面电荷数；④ 细胞内的pH值；⑤ 细胞和线粒体膜电位；⑥ 细胞质和膜结合的钙离子；⑦ 酶的活性；⑧ DNA合成能力；⑨ 细胞质网络的结构性；⑩ 细胞内和细胞膜受体等。 * 肝癌细胞流式仪检测结果：常规培养、加入G418、转染阴性载体、转染MTs RNAi 表1 脂质体转染MTs RNAi质粒后肝癌细胞周期的改变 组别 G1% S% G2% SMMC 7721 70.44 18.55 11.00 S+G418 50.10 34.63 15.27 S+G418+阴性载体 58.46 23.87 17.67 S+G418+MTs siRNA载体 59.17 27.67 13.16 * 7．激光扫描共聚焦显微术 激光扫描共聚焦显微术的基本原理是什么？与一般光镜相比，其优点是什么？ 激光扫描共聚焦显微术利用共焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层形态，用以观察细胞的形态学以及多种动力学功能的参数，了解细胞的解剖定位，阐明在完成细胞特殊功能时的各种细胞成分的作用，多种组分的相互作用以及其功能原理。由于它的高灵敏和能观察空间结构的独特优势，克服了过去对样品观察只停留在表面、单层、静态的局限性。 Hela凋亡过程中的FITC-AnnexinV和PI染色 * 其检测范围包括：蛋白质、抗体、配体及其他分子，核酸、细胞器（线粒体