第二章讲基因工程制药.pptVIP

;一、基因的概念: 　DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。;;;（一）、DNA的复制： 　　半保留复制; 二、基因表达;; 第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。;基因工程基本过程;⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。;基因工程药物制药的主要程序; 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。; ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定; 二、化学合成法; 人工化学合成基因的限制;筛选基因的其他方法;第四节 基因表达;一、最佳目的基因的要求;二、宿主细胞的选择; 发热量低、需氧低； 在适宜的环境下容易发酵； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 ; 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ;⒈ 原核细胞;; 分泌能力不强； 表达的蛋白质不能糖基化； 产物蛋白质N端有一个多余的蛋氨酸残基； 含有一定的内毒素很难除去。;;;⒉真核细胞;; 目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;Bam HⅠ;目的基因;基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列??转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;质粒 (plasmid);载体的选择标准;;二、大肠杆菌中的基因表达;;;;; 内切酶 (recBCD);5′;;;;;;;⑸应具有很强的终止子，只转录 克隆的基因，所产生的mRNA较为 稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的 起始信号AUG和SD序列，以便转录 后顺利翻译。 ;常用表达载体 -- 质粒pBV220的结构;;;;;融合表达质粒pBG-2的结构;⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素;;;⒊真核基因在大肠杆菌中的表达形式; ⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。; ⑶分泌型表达药物基因 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高， 信号肽不被切割。 ;三、酵母中的基因表达;⑴ 载体的复制系列可分四类： ①Yep类（yeast episomal plasmid， 酵母附加体质粒） ②YRp类（yeast replication plasmid， 酵母复制型质粒） ③YCp类（yeast centromeric plasmid， 酵母着丝粒质粒） ④YIp类（yeast integrative plasmid， 酵母整合型质粒）; ⑵ 克隆载体 ⑶ 表达载体 ①普通表达载体 ②精确表达载体;⒉影响目的基因在酵母菌中表达的因素;⑶外源蛋白的糖基化 ⑷宿主菌株的影响 　①菌体生长力强 　②菌体内源蛋白酶要较弱 　③菌体性能稳定 　④分泌能力强 ;四、动物细胞中的基因表达; 细胞生长慢，生产率低， 条件刻苛，费用高， 培养液浓度较小。 表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌尚有疑问。 ; 主要基因工程表达体系比较