5核酸与生命遗传.ppt

5` UpCpUpApApAp GpUpApAp 3` IVS Pre-rRNA 5` UpCpUp Ap Ap Ap GpUpApAp 3` pGOH A B A B 5` UpCpUOH3` 5`pGpApApAp GpUpApAp 3` A B 5` UpCpUpUpApAp 3` A B rRNA 5`pGpApApA GOH3` IVS 19个核苷酸残基 IVS 3、核酸的变性、复性和杂交 ：双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状，只涉及次级键的破坏。 （1）核酸的的变性 Tm Tm DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度(melting temperature, Tm)。 影响Tm的因素： （1）G-C的相对含量 （G+C）% =（Tm — 69.3）× 2.44 （2）介质离子强度低，Tm低。 （3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 （4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。 （2）核酸的复性（退火） ：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： （1）单链片段浓度 （2）单链片段的大小 （3）片段内重复序列的多少 （4）溶液离子强度的大小 （5）溶液温度的高低 （T – 25℃） （3）核酸的杂交 ：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。 探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。 原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。 点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。 Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。 Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。 5.5 核酸碱基顺序的测定 一、DNA碱基顺序测定方法 1、DNA碱基顺序测定的基本步骤 (1)DNA片段的制备：限制性内切酶技术，PCR技术 (2）DNA碱基顺序测定 目前多采用Maxam-Gilbert法（化学降解法）和Sanger法（末端 终止法）。 2、化学法（ Maxam-Gilbert法） （1）碱基选择性水解 限制性内切酶：1979年，W.Arber,H.Smith,D.Nathans等人发现， 主要在细菌中产生，具有极高的专一性，识别DNA双链上特定 的位点，将两条链都切开，形成粘性末端或平末端，只降解外 来DNA，酶切位点通常具回文结构。 EcoRⅠ: -N-C-T-T-A-A-G-N-5` 5`-N-G-A-A-T-T-C-N- HindⅢ: -T-T-C-G-A-A-5` 5`-A-A-G-C-T-T- 1）嘌呤碱基选择性水解：硫酸二甲酯处理DNA单链 2）嘧啶碱基的选择性水解： DNA单链用肼处理 （2） DNA片段电泳图谱的解析：将水解产物混合物进行凝胶电泳 ，得到电泳图谱。 5`-ATTGACTTAGCC-3` ATT+ACTTAGCC ATTGACTTA+CC ATT+ACTTA+CC 在G处切断 电泳，并用32P标记5`末端,根据电泳结果，推出G在第4位和第 10位。同理，推出A,C,T的位置. 3、末端终止法（Sanger法） (1)末端终止法合成不同长度DNA小片段,加入ddNTP,终止DNA 的合成。 O HOH2C H H OH 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 核 糖 N N N N H H H H 9 腺嘌呤 ddATP P P P 在DNA聚合酶的作用下,以DNA单链为模板,小 片段DNA为引物,将4种dNTP聚合成DNA互补 链. 引入ddNTP和32P标记的dATP （2）DNA小片段（合成产物）电泳图 谱的解析 4、DNA自动测序法：以Sanger法为基础，以荧光标记物代替同 位素标记,以不同颜色的因荧光代表4种碱基。 二、RNA碱基顺序测定方法 根据逆转录法，合成cDNA，再测定cDNA的碱基顺序，再得出 RNA的碱基顺序。 5.6 核酸的生物学功能 一、DNA复制与生物遗传信息的保持 复制要点： （1）在复制起始，DNA的双螺旋拆分成两条单链。 （2）以DNA单链为模板，按碱基互补配对原则，在DNA聚合酶 催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成新的DNA分子。 （3）新形成的DNA分子与原来的DNA分子完全相同。子代DNA 分子中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，称为半保 留复制。 二、RNA与生物遗传信息的表达 1、基因的转录——mRNA的合成 转录要点：以DNA为模板，在RNA聚合酶作用下，合成mRNA。 在mRNA分子中，