【特种医学】生物制品学2.ppt

3. 基因重组技术 定义 是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。 种类 目前，已从近300种不同的微生物分离出约500种限制性核酸内切酶。 类型（ 三种类型） ? 型酶、?? 型酶和 ??? 型酶。 若无说明，通常的限制性核酸内切酶就是指 ?? 型酶。 三种核酸限制性内切酶的主要特性比较 识别序列 定义 限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割位点。 长度 4、5、6或7个核苷酸。 结构特点 具有双重旋转对称结构，即：回文结构（palindromic sequence）。 切割方式 限制性核酸内切酶在基因重组中的用途 1. 分割基因组DNA; 定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3 ’-OH之间形成磷酸二酯键的酶。 活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口(gap)。 T4 DNA连接酶在基因重组中的用途 补缺口 平头末端连接 粘性末端连接 磷酸二酯法合成寡核苷酸 磷酸三酯法合成寡核苷酸 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸 概念：(Gene bank；Gene library) 将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小 的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组 DNA分子的群体。 载体(vector)的定义： 在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体，并能将重组体DNA导入受体细胞，使外源DNA得以复制或表达的DNA分子。 载体应具备的基本特性： 在宿主细胞中能独立复制； 具一段不影响其复制的非必需区域； 具1 ~ 2个选择标记； 分子量小，易操作； 多拷贝； 安全可靠。 来源与性质的不同 质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 噬菌粒载体 病毒载体 人工染色体等 功能和用途不同 克隆载体　　用于DNA片段的扩增 表达载体　　可在寄主细胞中表达性状 穿梭质粒　　可转化两种以上寄主细胞 根据受体细胞不同 大肠杆菌载体 酵母载体 动物基因工程载体 植物基因工程载体 等 痘苗病毒载体的特点： 痘苗病毒载体 痘苗病毒载体 载体与外源DNA用同一种限制酶处理后得到相同的粘性末端，碱基可以配对，由T4 DNA连接酶催化，进行两种DNA分子间的共价连接，形成重组体分子。 利用粘性末端进行DNA片段和载体DNA的体外重组 概念: 将宿主细胞（或 DNA受体细胞）与 DNA分子置于一个高强电场内，通过电场脉冲使宿主细胞发生电穿孔作用，使外源DNA分子随即进入的方法。 受体：细菌、真核生物 转化效率（细菌） 小质粒：109 转化子/微克DNA; 大质粒（100kb）：106 转化子/ μg DNA。 借助病毒转染细胞来实现外源基因的转移是病 毒转染法的基本思路。该技术使用的病毒主要 有痘苗病毒、腺病毒、逆转录病毒等。 抗性筛选 表达质粒载体 专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及适当的翻译调控序列。 启动子 PLac来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、 PTrp(色氨酸操纵子) PTac（来源于Lac和Trp的杂合启动子） 强转录终止序列 核糖体结合位点（S-D序列）、起始密码子、终密码止子 等 3 基因重组技术3.4 基因重组技术的载体3.4.3 质粒载体 pGEX表达质粒载体 酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其优势在于： 基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单； 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统； 不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全； 发酵工艺简单，成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 3 基因重组技术3.4 基因重组技术的载体3.4.4 酵母载体 按载体在酵母细胞中的复制形式分类 酵母整合载体（yeast integrating vector） 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome） 质粒载体 酵母附加型质粒（yeast episomal plasmid, YEp） 酵母复制质粒（