试验一氨基酸的分离鉴定纸层析法.pdfVIP

生物化学实验讲义 内蒙古科技大学生物与化学工程学院 基础生物教学部 2010 年 1 月 目 录 实验一 氨基酸的分离鉴定—纸层析法…………………………………………2 实验二 琼脂糖电泳法分离 DNA………………………………………………...3 实验三 乳中酪蛋白的分离……………………………………………………….5 实验四 3 ，5—二硝基水杨酸法测定还原糖…………………………………….6 实验五 蛋白质等电点测定和沉淀反应………………………………………….8 实验六 蛋白质的定量测定……………………………………………………...11 实验七 多酚氧化酶的制备和化学性质………………………………………...12 实验八 影响多酚氧化酶作用的各种因素……………………………………...14 实验九 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸………………………………………...16 实验十 维生素C的定量测定…………………………………………………...18 实验十一SDS凝胶电泳法测定分子量……………………………………………20 附录一 生物化学实验室规则…………………………………………………...23 附录二 实验室安全及防护知识………………………………………………...24 1 实验一 氨基酸的分离鉴定—纸层析法 一、实验目的 1. 学习纸层析法的基本原理和操作技术 2. 掌握氨基酸 Rf 值的计算方法 3. 掌握通过已知氨基酸对未知氨基酸和未知混合氨基酸组分进行鉴定 二、实验原理 层析法又称色层分析法，根据支持物的不同分为吸附层析、离子交换层析、 分配层析。纸层析是常用的、经典的分配层析技术，支持物是滤纸，固定相是水， 流动相为有机溶剂。 将样品点在滤纸上（这点称为原点），用扩展剂进行展层时，样品中各种的 溶质即在两相溶剂中不断的进行分配，由于个溶质在两相溶剂中的分配系数a（a= 溶质在流动相中的溶解度/溶质在固定相中的溶解度）不同，因而不同溶质随流 动相移动的速率不等，从而将其分离开来行程距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的位置可用比移值（Rf ）表示： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到扩展剂前沿的距离 对同一溶质来说，层析条件不变 Rf 是一常数，所以可以利用溶质的 Rf 值做 出定性分析。根据Rf 值可以用已知氨基酸鉴别未知氨基酸和混合氨基酸的组分。 三、实验材料、试剂和仪器 1. 材料、试剂 （1） 扩展剂 将 20ml 正丁醇和 5ml 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15ml 水混合，充分震荡， 静置后分层，放出下层水层。将漏斗内的扩展液放入磨口瓶中备用。 （2 ） 氨基酸溶液：0.5%赖氨酸；0.5%脯氨酸；0.5%缬氨酸；赖氨酸、缬氨酸、 脯氨酸混合溶液各组分的浓度均为 0.5% 。 （3 ） 显色剂：0.1%水和印三酮正丁醇溶液 2. 仪器：培养皿；滤纸；表面皿；毛细管；喷雾器 四、操作步骤 1. 取直径 12.5cm 圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线 上距圆心 0.5cm 处做标记（画一个点）并分别在其边缘上标上赖、脯、缬、 混等字样。 2. 用毛细管分别蘸取测定液各一滴，在滤纸的样应点样。等一次点样干了之后 再点一次，重复 2—3 次，点样直径不超过 3mm 。 3. 用小枪头或其它在滤纸圆心扎一小孔，另取滤纸将其卷成筒状，捻紧如灯芯， 底部用剪刀剪成碎条状，从滤纸的点样背面插入小孔，突出滤纸面约 0.5cm 。 4. 在表面皿中加入约 3ml 扩展液，再将其放入培养皿正中，将滤纸平放在培养 皿上，使滤纸芯浸入到扩展液中，盖上培养皿，待扩展剂距边缘 1cm 时，即 可取出停止层析。用铅笔画出扩展液前沿后，吹干或烘干。 5. 将滤纸平放在表面皿上，喷雾 0