组织培养以及与病毒细胞感染法.ppt

实验十一 组织培养与病毒的细胞感染法 练习内容 1．鸡胚纤维母细胞培养法（示教） 2．病毒的空斑形成试验（示教） 3．致细胞病变作用的观察（示教） 目的要求 1．了解细胞培养的原理与方法 2．了解病毒空斑形成试验方法与意义 3．了解病毒对细胞致病变作用的类型。 一、单层细胞培养法 （一）鸡胚纤维母细胞培养法 （二）人胚肾细胞培养法 二、人双倍体细胞培养法 双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而—直保持其双倍染色体的单层细 胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾 三、传代细胞培养法 传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双 倍体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如Hela细胞，KB细胞、 HEP—2细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间 隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮 四、器官培养 五、病毒的细胞感染法 在单层 细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验. 六、细胞致病作用的观察 细胞致病作用也称“细胞病变作用” （Cytopathic-effect，CPE），根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。 （一）全变型 指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。 （二）包涵体型 有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见表13—3）。 （三）融合型 有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。 【结果观察】 纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度： （－） —无细胞病变； （+） —25％以下的细胞有病变作用； （++） 一50％的细胞有病变作用； （+++） 一75％左右的细胞有病变作用； （++++） 一75％以上的细胞有病变作用； 某些病毒引起细胞病变的主要特征(表13—2 ) 练习内容 1．病毒的血球凝集试验 2．病毒的血球撬集抑制试验 目的要求 1．了解病毒的血清学试验方法与原理 2．掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读 血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。 三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验 某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点 .这里我们以新鸡城瘟病毒 NDV为例介绍血凝和血凝抑制试验。 【材料】 新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1份 0.5％鸡血球悬液 1管 生理盐水或PBS 1瓶 96孔微量血清盘 1块 微量稀释棒 1支 无菌试管 1支   【方法】 1．在微量血清盘的末孔标记为对照孔。 2．各孔中加生理盐水25微升。 3．取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即1∶10稀释）。 4．取1∶10病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸25微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次……依次稀释，直至第9孔弃去25微升。 5．各孔中加0.5％鸡红血球25微升充分摇匀。 6．置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。以45分钟为准。 新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5 ) 25 25 25 25 25 25 25 25 【结果判读】 各孔出现的血球凝集程度以+++、+++、++、++、+、—表示。 ++++为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底； +++约有50％血球发生凝集； ++约有50％血球发生凝集； +约有25％血球发生凝集； —不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘光滑，圆润。 血凝试验的结果以50％血球凝集（++）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为