2011秋-生化实验-7-核酸的分离纯化.pptVIP

实验六 组织DNA与RNA的分离和提纯 生物化学与分子生物学教研室 实验目的及意义 能够说出组织DNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备DNA 能够说出组织RNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备RNA。 前言 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 分离纯化核酸的原则 应保证核酸一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求 减少化学因素对核酸的降解： 温度不要过高； 控制pH值范围(pH值5-9); 保持一定离子强度; 减少物理因素对核酸的降解： 避免机械剪切力破坏核酸结构 分离纯化核酸的原则 防止核酸的生物降解： 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 分离纯化核酸的原则 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。 核酸的性质 DNA、RNA的理化性质特点： 核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性，等电点比较低。如DNA的等电点为pI 4-4.5，RNA的等电点为pI 2-2.5。 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。 DNA和RNA都是极性化合物，因此他们一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。 核酸的性质 核酸的存在方式： DNA和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白）和RNP（核糖核蛋白）。 核酸纯化原理 DNA分离纯化原理： 脱氧核糖核蛋白（DNP）在0.14 mol/L NaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）却较易溶解，因此用上述浓度的NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即可得到DNA。 RNA分离纯化原理： 组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，RNA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA则溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。 尽量保持低温下操作，作时注意避免破坏核酸结构 一般来讲，核酸沉淀应在低温下长时间下进行。但是低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。因此一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。 使用酚时应注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物。变色的酚不能用于核酸抽提实验，氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。 注意事项 DNA分离纯化实验步骤 剪碎组织 放入匀浆器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液7 mL 弃上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液3 mL混匀。 匀浆，分装于两个5 mL离心管中 5000 r/min ，5 min 两管沉淀中各加入1.5 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA, 合并，转入匀浆器匀浆，在搅拌下缓缓滴入250 g/L SDS 0.4 mL 匀浆，使沉淀悬浮均匀 再加入2 mol/L NaCl 4 mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀） 转入三角烧瓶 加氯仿-异丙醇 5 mL，剧烈振摇10min。混合物分装于5 mL离心管中 上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。 吸出上层水液边摇变加入等体积95% 乙醇，即可见有长纤维状DNA析出 5000 r/min 离心5 min 3000 r/min离心10 min RNA分离纯化实验步骤 加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液, 250 g/L SDS 0.5 mL，匀浆 移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min， 取出流水冷却 分装于5mL离心管中5000 r/min 离心10 -15min 上层为稍浑浊含有RNA的水相，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残渣含有DNA。 收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10 体积的2 mol/L 醋酸钠溶液，混匀。再加2.5 倍体