PYTHIUM SYLVATICUM 鉴定37.pdf

菌 物 学 报 23 （3 ）：356~365, 2004 Mycosystema P YTHIUM SYLVATICUM 鉴定及其专一性PCR 引物 楼兵干 张炳欣 (浙江大学生物技术研究所 杭州 310029) 摘 要：从杭州采集的水稻、棉花和大豆猝倒苗中分离到国内新记录腐霉种Pythium sylvaticum 。 该腐霉为异宗配合种，菌丝膨大体球形或柠檬形，雄器异丝生，藏卵器光滑，每个藏卵器上 1~3 个雄器，雄器常在接近藏卵器处形成二叉状分枝，卵孢子不满器。测定了该种4 个菌株 的核糖体内转录间隔区（ITS ）的序列，根据与59 种腐霉ITS 序列的比较，设计了P. sylvaticum 种专一性引物PSF1 和PSR2 。实际结果表明：该引物能从11 种共 14 株腐霉DNA 中特异性 地扩增P. sylvaticum ，从而与其它10 种腐霉区分。 关键词：核糖体内转录间隔区序列，ITS 序列比对，设计引物 中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472 （2004 ）03-0356-0365 Campbell Hendrix （1967）在美国的土壤中最初分离到腐霉种Pythium sylvaticum W. A. Campbell F. F. Hendrix ，随后，加拿大、荷兰、德国和土耳其都有从土壤中分离到该种腐 霉的报道。P. sylvaticum 引起苹果、小麦、亚麻、碗豆、胡萝卜、莴苣、黄瓜、草莓、棉花 等多种植物苗期发生猝倒病，给种植业造成严重损失（Campbell Hendrix , 1967; Blok, 1970; Johnson et al., 1978）。 P. sylvaticum 是首次报导的异宗配合腐霉种（Campbell Hendrix, 1967 ）。单株培养时常 常不形成有性器官，即使长期培养后，雌性菌株（female isolates ）也只能产生藏卵器。由于 腐霉种的形态鉴定和分类主要依据藏卵器、卵孢子、雄器和孢子囊等形态特征进行，若没有 相互匹配的菌株，势必限制了病原腐霉诊断及其生态学研究。 由于分子生物学能提供许多与遗传背景相关的信息，近年来，采用分子生物学的方法对 微生物进行鉴定和分类已经较普遍。Martin （1991）根据P. sylvaticum 与其它种之间的线粒 体DNA （mtDNA ）多态性之间的差异，构建了用于检测该种的特异性DNA 探针。虽然DNA 探针灵敏度较高，但如果某研究者决定利用该探针分离、鉴定 P. sylvaticum，探针必须由原 来的研究者提供或按原来研究者的方法重新获得探针，才能做类似试验。PCR 技术具有高度 的敏感性、可重复性和引物易合成的特点，如果设计出种的专一性引物，引物就能独立合成， 其它研究人员就可以采用相同的方法进行P. sylvaticum 鉴定和检测。这方面在终极腐霉 P. ultimum Trow 和寡雄腐霉P. oligandrum Drechsler 的研究中已有报道(Kageyama et al. ，1997; Scott et al., 2003)。 从杭州郊区水稻、棉花和大豆猝倒病苗中分离到的国内新记录腐霉种P. sylvaticum 的形态学特征、核糖体内转录间隔区（ITS ）序列，根据与其它59 种腐霉ITS 序列的比较， 设计并合成了P. sylvaticum 专一性PCR 引物，并对这一引物的特异性进行了验证。 基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（M303444 ） 收原稿日期：2004-03-08 ，收修改稿日期：2004-05- 12 3 期 楼兵干等：Pythium sylvaticum 鉴定及其专一性PCR 引物 357 1 材料与方法 1.1 菌株分离、纯化与鉴定 采集杭州郊区发生猝倒的水稻、棉花、大豆、黄瓜、辣椒等苗，用组织分离法，在腐霉 选择性培养基VP3 平板上分离和纯化腐霉菌株(Ali Shtayeh et al., 1986)，在玉米琼脂培养基 （cornmeal agar,